HET GEBRUIK VAN PLATELET-RICH PLASMA IN LOCOMOTORISCHE AANDOENINGEN

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar HET GEBRUIK VAN PLATELET-RICH PLASMA IN LOCOMOTORISCHE AANDOENINGEN Daphné VANDAMME Promotor: Prof. Dr. J. Victor Co-promotor: Prof. Dr. F. Almqvist Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding MASTER IN DE GENEESKUNDE

2

3 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar HET GEBRUIK VAN PLATELET-RICH PLASMA BIJ LOCOMOTORISCHE AANDOENINGEN Daphné VANDAMME Promotor: Prof. Dr. J. Victor Co-promotor: Prof. Dr. F. Almqvist Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding MASTER IN DE GENEESKUNDE

4 De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. Datum Daphné Vandamme Prof. Dr. J. Victor

5 VOORWOORD Deze masterproef werd geschreven in het kader van de opleiding Master in de Geneeskunde aan de universiteit van Gent. Eerst en vooral zou ik Prof. Dr. F. Almqvist willen bedanken voor het aanreiken van dit bijzonder boeiend onderwerp waar ik me gedurende de afgelopen 2 jaar met veel plezier in heb verdiept. Mijn dank gaat ook uit naar Juri Planckaert voor het vlot laten verlopen van de communicatie tussen mijn promotors en mezelf. Ik kon steeds bij hem terecht met mijn vragen en bezorgdheden. Bovenal wil ik Prof. Dr. J. Victor bedanken die ondanks alle drukte, tijd heeft vrijgemaakt om me bij te staan met advies en tips. In tijden waar het wat moeilijker ging en de stress de kop op stak heeft hij me ten volle aangemoedigd en zijn aanstekelijk enthousiasme op mij overgebracht, waarvoor oprechte dank! Ook een oprechte dank aan mijn zus, Céline Vandamme, die me geholpen heeft op een gestructureerde wijze te werk te gaan en me steeds heeft bijgestaan met raad een daad, aan Stéphanie Bosschem die mijn tekst met veel plezier heeft nagelezen en aan Maarten Tortelboom die me geholpen heeft met de lay-out en allerhand computerproblemen en tenslotte aan mijn ouders die me steeds 100% gesteund hebben doorheen mijn volledige opleiding.

6 INHOUDSTAFEL Voorwoord... 1 Afkortingen Abstract Inleiding Trombocyten PRP Groeifactoren IGF-I VEGF TFGβ bfgf PDGF Genezingsproces Pees Spier Bot Methodologie Zoekstrategie Datacollectie Resultaten Pees en ligament In vitro studies In vivo studies Spier Bot In vitro studies In vivo studies Veiligheid Discussie Pees en ligament Spier Bot... 38

7 6 Conclusie Referentielijst... 42

8 Afkortingen ADP = Adenosinedifosfaat ATP = Adenosinetrifosfaat bfgf = FGF2 = Basic fibroblast growth factor BMC = Beenmerg cel BMSC = Beenmerg stamcel BP = Bone plug CCT = Non-randomized Controlled clinical trial DASH = Disabilities of arm, shoulder and hand DNA = Desoxyribonucleïnezuur DO = Distractie Osteogenese ECM = Extracellulaire matrix EDTA = Ethyleendiaminetetra-azijnzuur EGF = Epidermal growth factor FDBA = Freeze-dried bone allograft GAG = Glucosaminoglycanen GF = Groeifactoren HGF = Hepatocyte growth factor HI = Healing index IGF = Insulin-like growth factor L-PRG = Leucocyte platelet-rich gel L-PRP = Leucocyte platelet-rich plasma MGF = Mechano-groeifactor MMP = matrix metalloproteïnase MRI = Magnetic resonance imaging mrna = Messenger ribonucleic acid NGF = Nerve growth factor PDGF = Platelet-derived growth factor PEDro = Physiotherapy evidence database PIGF = Placenta growth factor PPCR = Platelet-poor clot releasate PPP = Platelet-poor plasma P-PRG = Pure platelet-rich gel P-PRP = Pure platelet-rich plasma PRCR = Platelet-rich clot releasate PRP = Platelet-rich plasma

9 RBC = Rode bloedcel RCT = Randomized controlled trial rhbmp-7 = Recombinant human bone morphogenetic protein-7 rhvegf (165) = Recombinant human vascular endothelial growth factor (165) RICE = Rest, ice, compression and elevation RT-PCR = Reverse transcription polymerase chain reaction TGF = Transforming growth factor TSC = Tendon stemcells UCLA = subjective questions of the University of California in Los Angeles VAS = Visuele analoge schaal VEGF = Vascular endothelial growth factor VISA-A = Victorian institute of sports assessment - Patella VKB = Voorste kruisband WADA = World anti-doping agency

10 1 Abstract Er wordt constant onderzoek verricht naar nieuwe behandelingsmethodes voor de genezing van musculoskeletale letsels in de orthopedie. Eén van deze nieuwe potentiële behandelingen is het gebruik van Platelet-rich plasma. Dit is de benaming voor een product afkomstig van autoloog bloed dat een verhoogde concentratie aan trombocyten in plasma bevat. Deze trombocyten spelen een belangrijke rol in de hemostase en het genezingsproces waar zij groeifactoren, cytokines, proteïnes en allerlei andere moleculen gaan vrijgeven na activatie. De gekende groeifactoren die worden vrijgegeven door de trombocyten en het plasma in Platelet-rich plasma (=PRP) zijn Platelet-derived growth factor (=PDGF), Transforming growth factor β (=TGF-β), Vascular endothelial growth factor (=VEGF), Insulin-like growth factor-i (=IGF-I), Fibroblast Growth factor (=FGF), Hepatocyte growth factor (=HGF) en Epidermal Growth factor (=EGF). Elk van deze groeifactoren afzonderlijk heeft een aantal bewezen stimulerende effecten op verschillende fasen in botheling, spierheling, pees- en ligamentheling enz. Er zijn 4 soorten PRP namelijk Pure Platelet-rich plasma (=P-PRP), Leucocyte and platelet-rich plasma (=L-PRP), Pure platelet-rich fibrin (P-PRF) en leucocyte-and platelet-rich fibrin (L-PRF). Men kan PRP aanbrengen via een injectie, plaatselijk als gel of d.m.v. een drager. PEES: Resultaten van in vitro onderzoek tonen aan dat PRP de proliferatie, differentiatie en collageenproductie in peescellen stimuleert. In vivo onderzoek op dieren toont een positieve invloed van L-PRP op peeslaesies en voorste kruisbanddefecten. In vivo studies op de mens tonen een duidelijk beter effect van L-PRP op elleboogtendinopathieën in vergelijking met corticosteroïden. Het gebruik hiervan voor patellapeestendinopathieën is hoopgevend maar de voorlopige studies zijn schaars en niet goed van design. Verder onderzoek is daarom noodzakelijk. Voor achillespeesruptuur toont een niet-gerandomizeerde, gecontrolleerde klinische trial (=CCT) met een minder goed design hoopgevende resultaten. Echter het gebruik van een L-PRP injectie in achillespeestendinopathie is voorlopig niet effectief bewezen. De studies i.v.m. het gebruik van PRP in Voorste Kruisband (=VKB)-letsels tonen positieve tekens op MRI maar de correlatie tussen MRI beelden en de kwaliteit van de VKB is nog niet gewezen. Tenslotte is er te weinig onderzoek gedaan naar rotatorcuffpathologie om hier uitspraken over de eventuele werking ervan te kunnen doen. SPIER: Over het effect van PRP op spierletsels is weinig geweten. De enige gevonden gecontroleerde studie is een CCT verricht op muizen. Deze heeft goede resultaten met een duidelijke verbetering in contractie en een sneller volledig herstel van multipele kleine verrekkingen. Er zijn 2 case series verricht op mensen die een goede evolutie in genezing vinden zonder vermelding van belangrijke nevenwerkingen of complicaties. De huidige bevindingen zijn positief voor het gebruik van PRP in spierletsels maar voorzichtigheid is geboden aangezien er nog geen duidelijke evidentie is. 1

11 BOT: In vitro studies tonen een stimulatie van de proliferatie van stromale beenmergcellen en een inhibitie van de differentiatie van pre-osteoblasten in ratten. Er wordt wel een differentiatie gezien van menselijke osteoblast-achtige cellen na toevoeging van P-PRP. In vivo studies op dieren tonen een beter effect op botvorming door het gebruik van een autoloog bottransplantaat of Bio-Oss. Ook L- PRP heeft geen meerwaarde bovenop het gebruik van gevriesdroogde botgreffes voor de fixatie van een hydroxyappatiet-gecoat titaniumimplantaat in de humerus. Er is echter wel een bewezen versnelde botheling en een sneller remodelleringsproces bij combinatie van PRP met beenmergstamcellen (=BMSC) en gevriesdroogde botallogreffes (=FDBA). De combinatie van beenmergcellen (=BMC) en P-PRP gebruikt in disctractie-osteogenese bij de mens leidt tot goede resultaten op vlak van een snellere genezing en minder complicaties maar het is niet duidelijk of het positieve effect op de genezing afkomstig is van BMC of P-PRP of de combinatie hiervan. Voor de behandeling van nonunion fracturen is het wel duidelijk dat het gebruik van rhbmp-7 superieur is t.o.v. P-PRP Er lijkt een toekomst te zijn voor het gebruik van PRP in de behandeling van locomotorische aandoeningen. Vooral bij het gebruik van peesletsels kan dit eventueel als laatste conservatieve behandelingsoptie aangeboden worden, maar verder onderzoek blijft noodzakelijk. Voorlopig is er echter onvoldoende bewijs om de behandeling van spier en botletsels met PRP in niet experimentele situaties te rechtvaardigen. Men moet hier eerst verder onderzoek naar verrichten. 2

12 2 INLEIDING Het genezen van chronische musculoskeletale letsels is een blijvende uitdaging in de orthopedie. Het zijn veelvoorkomende letsels die bij iedereen kunnen optreden, gaande van de gemiddelde populatie tot fervente sporters, met een grote socio-economische impact als gevolg. Het is vaak een langdurig proces dat niet altijd volledige genezing met zich meebrengt, daarom wordt er veel onderzoek verricht naar nieuwe, hopelijk betere therapieën. Eén van deze onderzochte therapieën is het gebruik van groeifactoren, met name Platelet-rich plasma (PRP). PRP is een product, afkomstig van autoloog bloed met een verhoogde concentratie aan trombocyten in plasma. Deze plaatjes spelen een centrale rol in de hemostase waarbij ze onder andere groeifactoren, cytokines en proteïnes gaan uitscheiden die belangrijk zijn voor bot- en weefselregeneratie. Ze kunnen in suprafysiologische concentraties aangebracht worden ter hoogte van het letsel met als doel de genezing te bevorderen. Reeds jaren wordt het gebruik van PRP beschouwd als dé toekomst in de therapie van moeilijk te behandelen letsels aan ligamenten, pezen, spieren en botten. Men heeft hoge verwachtingen van deze relatief eenvoudige en minimaal invasieve technologie. Dit is een veel besproken, toch wel controversieel onderwerp waaromtrent nog veel onduidelijkheid bestaat, met weinig hoogkwalitatieve gerandomiseerde studies. Het gebruik van PRP doet denken aan het gebruik van bloedproducten die worden beschouwd als doping, daarom heeft dit product in 2010 tijdelijk op de lijst met verboden producten van de World Anti-Doping Agency (=WADA) gestaan. PRP wordt geïnjecteerd in letsels of via een medium aangebracht tijdens chirurgie. Het bevat groeifactoren die enkel inwerken op dit specifiek weefsel. Genezing wordt bevorderd, maar atleten moeten minstens enkele weken wachten alvorens ze hun sport opnieuw kunnen beoefenen. Wanneer ze hun sportactiviteiten kunnen hervatten zijn er geen hogere concentraties aan groeifactoren meer detecteerbaar ter hoogte van het letsel (1). Hoewel het product afkomstig is van bloed, is er geen bewijs dat dit sportprestaties verbetert. Daarom is WADA op zijn beslissing teruggekomen en staat PRP sinds 2011 niet meer op de verboden lijst (2). In deze masterproef wil ik aan de hand van wetenschappelijke publicaties met een goed design, duidelijkheid scheppen over de effectiviteit en efficiëntie van het gebruik van PRP voor behandeling van pees-, ligament-, spier- en bot-letsels. 3

13 2.1 TROMBOCYTEN Bloedplaatjes of trombocyten zijn anucleaire cytoplasmatische fragmenten van megakaryocyten met een diameter van 2 à 3 µm (3). Hun normale concentratie in het bloed reikt van plaatjes/µl tot plaatjes/µl. Ze spelen een cruciale rol in de hemostase waar ze ter hoogte van een vasculair letsel d.m.v. adherentie, aggregatie en klontervorming een bloeding gaan stelpen. Ze zijn de eerste cellen die naar de plaats van het letsel worden gebracht, waar ze een hoofdrol spelen in het mediëren van genezing. Dit doen ze onder andere door het vrijgeven van groeifactoren vanuit hun alfa-granulen. Deze groeifactoren zijn een diverse groep polypeptiden, bestaande uit PDGF, TGF-β, VEGF, IGF-I, FGF en EGF (4-7). HGF en deels ook IGF-I worden eveneens teruggevonden in PRP maar zijn afkomstig vanuit het plasma dat de plaatjes omvat (7). Alfa-granulen hebben een diameter van 200 tot 500 nm en er worden hiervan 50 à 80 gevonden in elke trombocyt (8). Na plaatjesactivatie gaan deze granulen versmelten met het celmembraan om hun inhoud vrij te geven (3). Ze bevatten in totaal ongeveer 30 bioactieve proteïnes waaronder cytokines, chemokines en vele andere proteïnen die betrokken zijn bij de stimulatie van chemotaxis, celproliferatie en -maturatie, het moduleren van inflammatoire moleculen en het aantrekken van leukocyten (9). Ze bevatten 3 celadhesie moleculen, namelijk fibrine, fibronectine en vitronectine die osteoconductie stimuleren. Deze dienen ook als matrix voor bindweefsel- en epitheelmigratie (10). Tenslotte bevatten alfa-granulen dense granulen die ADP, ATP, calcium-ionen, histamine, serotonine en dopamine kunnen opslaan en vrijgeven afhankelijk van hun activatie. Dit is belangrijk voor weefselmodulatie en -regeneratie (11). Het adenosine uit ADP en ATP speelt een belangrijke rol in het overdragen van energie, het is ook een primair cytoprotectieve stof die helpt weefselschade te voorkomen en het speelt een rol in de regeling van inflammatie. Serotonine kan de capillaire permeabiliteit nog meer versterken dan histamine. Het is een chemoattractans voor fibroblasten en verhoogt hun proliferatie. Histamine speelt een rol in de lokale immuunrespons. Het handelt als een vasodilatator en verhoogt de permeabiliteit van het microvasculair systeem waardoor een betere toegang voor immuuncellen ontstaat. Het is ook een sterke activator van macrofagen. Calcium speelt een rol in wondgenezing door proliferatie en differentiatie van keratinocyten en huidfibroblasten. Het is noodzakelijk voor migratie en regeneratie van epidermale cellen in de remodelleringsfase (11). Plaatjes bestaan niet enkel uit alfa-granulen maar bevatten eveneens een voorraad antibacteriële- en antischimmelproteïnes om infecties te voorkomen, proteasen (zoals metalloprotease-4), coagulatiefactoren en membraanglycoproteïnen die inflammatie kunnen beïnvloeden door synthese van andere integrines, interleukines en chemokines (9). Verder bestaan de plaatjes nog uit lysosomale granulen die zuur hydrolasen, cathepsine D en E, elastasen en lysozyme secreteren (12). 4

14 Figuur 1: Schematisch overzicht van een geactiveerd plaatje. Links: een plaatje in rusttoestand. Rechts: een geactiveerd plaatje met ontwikkeling van pseudopodia als gevolg, om degranulatie te stimuleren. (Deze figuur komt uit Everts PA, Knape JT, Weibrich G, Schonberger JP, Hoffmann J, Overdevest EP, et al. Platelet-rich plasma and platelet gel: a review. The Journal of extra-corporeal technology. 2006;38(2): Epub 2006/08/23. (13)) 2.2 PRP De term PRP of Platelet-rich plasma is voor het eerst gebruikt in de transfusiegeneeskunde. Het is een concentratie aan trombocyten die wordt gebruikt voor de behandeling of preventie van bloedingen als gevolg van een ernstige trombopenie. Deze concentraties zijn gestandaardiseerd op 0,5 x trombocyten per toegediende eenheid plasma (6). De hypothese dat groeifactoren in PRP de genezing kunnen stimuleren heeft geleid tot een aanzienlijke interesse vanuit de commerciële sector. Hierdoor is er een grote variatie aan preparatie protocollen en centrifuges ontstaan, waarbij de bekomen producten allen PRP worden genoemd, een naam die niet toelaat onderscheid te maken tussen de verschillende manieren van produceren en hun bekomen producten (6). De verschillende methodes voor het maken van PRP onderscheiden zich onder andere d.m.v. de concentraties van plaatjes, het al dan niet aanwezig zijn van een grote hoeveelheid witte bloedcellen, het gebruik van verschillende anticoagulantia, etc. Deze factoren kunnen de resultaten van studies beïnvloeden, dit noemt men confounders. Dit maakt het heel erg moeilijk om de doeltreffendheid van verschillende onderzoeken en studies juist te beoordelen. Men kan PRP verdelen in 4 categorieën: pure platelet-rich plasma (P-PRP), leukocyte- and plateletrich plasma (L-PRP), pure platelet-rich fibrin (P-PRF) en leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). De eerste 3 PRP-producten hebben enkele punten gemeen: bloed wordt verzameld samen met anticoagulantia juist voor of tijdens een ingreep en het wordt onmiddellijk gecentrifugeerd. De duur en 5

15 de kracht van de centrifugatie is afhankelijk van het toestel, maar dit wordt steeds voltooid binnen het uur. De eerste stap in de centrifugatie dient om bloed in 3 lagen te verdelen: de onderste laag bestaande uit rode bloedcellen, de bovenste laag, die celarm plasma bevat of PPP (Platelet-poor plasma) en de laag er tussenin, genaamd de buffy coat waar plaatjes maar ook leukocyten in geconcentreerd zijn. De volgende stappen dienen om de buffy coat te isoleren en variëren van methode tot methode. Om P-PRP te bekomen zal men na een 1 ste centrifugatie met trage centrifugale krachten (softspin) de PPP en de oppervlakkige buffy coat verzamelen in een andere buis. Na een tweede centrifugatie met grote centrifugale krachten (hardspin) van de nieuw bekomen concentratie, zal het grootste deel van de PPP-laag verwijderd worden. Het finale P-PRP bestaat dan uit een fractie van de buffy coat, die een groot aantal plaatjes bevat en een fractie fibrine-rijk plasma, die uiteindelijk ook een redelijke concentratie plaatjes bevat. De meeste leukocyten worden niet verzameld. Om L-PRP te bekomen zal men na de initiële softspin de PPP en de volledige buffy coat verzamelen waar er onvermijdelijk ook enkele RBC zullen inzitten. Men voert dan een hardspin centrifugatie uit om het PPP van de buffy coat te scheiden en te verwijderen. Het uiteindelijke L-PRP zal bestaan uit de volledige buffy coat en enkele residuele RBC in een kleine hoeveelheid fibrine-rijk plasma (6). Figuur 2: Manueel P-PRP en L-PRP protocol gebruik makend van 2 centrifuges. Stap 1: Vol bloed met anticoagulans wordt gecentrifugeerd met een trage centrifugale kracht (softspin). Hierdoor onstaan 3 lagen: rode bloedcellen (RBC), buffy coat (BC) en platelet-poor plasma (PPP). Stap 2a: voor de productie van P-PRP worden PPP en de oppervlakkige laag van BC overgezet in een andere buis waar ze een hardspin centrifugatie ondergaan. Het grootste deel van de PPPlaag wordt verwijderd. Het uiteindelijke P-PRP bestaat uit een fractie van de BC in fibrine-rijk plasma. De meest leukocyten zijn hieruit verwijderd. Stap 2b: Om L-PRP te bekomen wordt het PPP, de BC laag en de oppervlakkige laag van de RBC verzameld en deze ondergaan een hardspin centrifugatie. PPP wordt hier verwijderd. Het uideindelijke L-PRP bestaat uit de BC en een fractie RBC in een fibrine-rijk plasma. (Deze figuur komt uit Dohan Ehrenfest DM, Rasmusson L, Albrektsson T. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends in biotechnology. 2009;27(3): Epub 2009/02/04.(6)) 6

16 Uiteindelijk zal de bekomen trombocytenconcentratie aangebracht worden met een spuit, onmiddellijk na toevoeging van trombine en/of calciumchloride (of vergelijkbare adjuvantia) om zo de plaatjesactivatie en fibrine polymerisatie te initiëren (6). Soms wordt hier echter geen trombine en calciumchloride aan toegevoegd en activeert men het geïnjecteerde PRP met behulp van de peppering technique. Dit is een techniek waar met een naald of met de spuit die PRP bevat, het te behandelen weefsel verschillende keren doorprikt wordt. Hierdoor ontstaat er een hematoom met vorming van trombine als gevolg, die op zijn beurt het geïnjecteerde PRP zal activeren (14). Het type I collageen waaraan trombocyten worden blootgesteld na inspuiting kan ook dienen als activator, men heeft gezien dat ondanks minder opvallende inkrimping van de klonter het toch resulteert in een gelijkaardige vrijstelling van PDGF-AB en VEGF. Er wordt wel een lagere concentratie aan TGF-β1 gevonden in de eerste 5 dagen na activatie in vergelijking met activatie d.m.v. trombine (15). Indien de trombine en/of calciumchloride vroeger aan het PRP-concentraat wordt toegevoegd dan juist voor gebruik, wordt het proces van coagulatie reeds geïnitieerd. Dit is een traag proces van trombineregeneratie, plaatjesactivatie, fibrineformatie en degranulatie dat eindigt in inkrimping van de klonter, waarbij de media rond deze klonter proteïnen zal bevatten, zoals groeifactoren en andere moleculen betrokken in de genezing. In in vitro studies zal men trachten deze media te pipeteren om enkel dit te gebruiken, dit wordt Platelet-rich clot releasate (=PRCR) genoemd (16, 17). Als men het volledige bekomen product inclusief de klonter gebruikt spreekt men vaak van Platelet-rich gel. Dit kan men niet meer inspuiten omwille van zijn viskeuzere consistentie, maar brengt men rechtstreeks aan op het beschadigde weefsel tijdens een heelkundige ingreep. Platelet-rich gel is dus hetzelfde als PRP maar de plaatjesactivatie wordt reeds gestart voor het aangebracht wordt ter hoogte van het letsel, met een viskeuzere vorm tot gevolg. Er bestaat dan ook P-PRG en L-PRG afhankelijk van het beginproduct: P-PRP of L-PRP (18-20). Bij productie van P-PRF zal men samen met het toevoegen van een anticoagulans ook een scheidingsgel toevoegen die ervoor zal zorgen dat na centrifugatie de leukocyten zoveel mogelijk van de buffy coat gescheiden zullen worden. Na de eerste centrifugatie kan men dan de buffy coat en PPP collectioneren en hier nu reeds een calciumchloride aan toevoegen, zodat klontervorming meteen getriggerd wordt. De 2 de centrifugatie begint onmiddellijk zodat een P-PRF klonter gemakkelijk gecollecteerd kan worden. Het verschil tussen P-PRF en P-PRG is miniem maar P-PRG wordt niet meer gecentrifugeerd na toevoeging van een plaatjesactivator. Of dit een verschil uitmaakt in het eindproduct is niet duidelijk. Dit zou verder onderzocht moeten worden. Choukroun s PRF (platelet-rich fibrin) varieert van deze protocollen aangezien hier bloed verzameld wordt zonder anticoagulans en dit onmiddellijk wordt gecentrifugeerd. Hierop volgt een natuurlijk stollingsproces dat eenvoudige collectie van een Leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF) klonter 7

17 toelaat. Biochemische veranderingen van het bloed, zoals toevoeging van anticoagulantia, trombine of calciumchloride, zijn hier niet van toepassing. De aanwezigheid van een verhoogde concentratie aan leukocyten in PRP is een punt van discussie. De voorstanders voor L-PRP en vooral de bedrijven die L-PRP produceren zijn van mening dat leukocyten de genezing stimuleren, aangezien deze witte bloedcellen ook GF zoals VEGF vrijgeven (6, 21). Ze hebben een antibacterieel effect en bevatten het vermogen dood weefsel te verwijderen. De P-PRP voorstanders zijn van mening dat leukocyten schadelijke effecten hebben op genezend weefsel door het vrijgeven van matrix metalloproteїnases door neutrofielen. Dit is echter nog niet aangetoond in een RCT (21). Er is tot nu toe nog geen melding gemaakt van een ongecontroleerde immuunreactie door het gebruik van L-PRP en sommige studies tonen zelf een vermindering van pijn en inflammatie ter hoogte van de plaats van behandeling (6). De fibrinogeenconcentratie verschilt sterk voor de verschillende PRP methodes, net als zijn densiteit en compositie. In P-PRP is het aanwezige fibrinogeen voornamelijk afkomstig van de alfa-granulen van de plaatjes na activatie. De uiteindelijke fibrineconcentratie is zeer laag. In andere protocollen wordt het circulerend fibrinogeen mee opgenomen (6). Figuur 3: Schematische illustratie van de matrix en celarchitectuur van de 4 plaatjesconcentraties: De blauwe bollen zijn leukocyten en de grijze lijnen zijn fibrinedraden. Plaatjesaggregaties (de grijs-blauwe structuren) gaan zich schikken rond de fibrinedraden. In P-PRP en L-PRP is het fibrinenetwerk immatuur en bestaat het voornamelijk uit draden met een smalle diameter (rode pijlen). Dit fibrinenetwerk ondersteunt plaatjesapplicatie tijdens chirurgie maar ontbindt snel. In P-PRF en L-PRF zijn fibrinedraden dik (zwarte pijlen) en vormen een resistente matrix. (Deze figuur komt uit: Dohan Ehrenfest DM, Rasmusson L, Albrektsson T. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends in biotechnology. 2009;27(3): Epub 2009/02/04.(6)) 8

18 2.3 GROEIFACTOREN Om het gebruik van PRP als stimulator van genezing te onderzoeken is het goed te weten wat de rol is van de verschillende componenten in dit product IGF-I De Insulin-like growth factor familie wordt onderverdeeld in 2 subklassen: IGF-I en IGF-II (22). IGF- I is een enkelvoudige keten polypeptide met een gelijkaardige structuur als proinsuline. Het speelt zowel een rol in de genezing als in de normale groei van het lichaam (23). IGF-I bevat minstens 3 isovormen: IGF-IEa, IGF-IEb en IGF-IEc en wordt vrijgesteld door verschillende bronnen. IGF-IEa is de circulerende vorm van IGF-I en wordt vrijgegeven door de lever als reactie op het groeihormoon dat vrijgesteld wordt door de hypofyse. De hypofyse wordt op zijn beurt gestimuleerd door Growth hormone releasing hormone, afkomstig van de hypothalamus. Dit endocrien systeem wordt gecontroleerd door een negatief feedbackmechanisme, waardoor een exogene toediening van IGF-I zal leiden tot een suppressie van de as. De IGF-IEc isovorm, ook gekend als de mechano-groeifactor (= MGF) is de isovorm die wordt vrijgesteld uit skeletspieren na contractie hiervan (7, 24). Een 3 de bron van vrijstelling zijn de alfa-granulen uit de trombocyten. Dit mechanisme zorgt voor secretie in de omgeving van beschadigd weefsel (12). Men denkt dat de plaatjes een beperkt aantal IGF-I vrijstellen, terwijl het meeste IGF-I aanwezig in PRP voorkomt uit het plasma (25). Het IGF-I dat teruggevonden wordt in PRP is de isovorm IGF-IEa (7). De verschillende isovormen hebben verschillende biologische acties. IGF-IEa stimuleert de differentiatie van spiercellen in myotubes en promoot de stamcel-gemedieerde spierregeneratie, terwijl MGF het lokale weefsel herstelt en meer dan IGF-IEa hypertrofie kan veroorzaken. Het MGF wordt snel gedegradeerd in het serum (24). De verschillende biologische werkingen van de verschillende isovormen zijn belangrijk aangezien IGF-I, afkomstig van PRP (IGF-IEa), niet dezelfde effecten heeft als IGF-IEc (MGF), afkomstig van de skeletspieren. IGF-I bindt aan 2 types receptoren namelijk de IGF-receptor en de mannose-6-fosfaat-receptor (26). IGF-I circuleert in het serum voor 99% gebonden aan een dragereiwit namelijk insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3). Slechts 1% van het serum IGF-I is vrij, het is deze vrije fractie waarvan men denkt dat de biologische effecten door het binden aan de IGF-I-receptor afkomstig zijn (27), het is dan ook deze niet gebonden vorm die wordt toegediend d.m.v. PRP (7). IGF-I heeft een serum halfwaardetijd van 10 minuten wanneer het niet gebonden is aan IGFBP-3 (52). IGF-I levels variëren sterk tussen verschillende individuen en zijn afhankelijk van genetische eigenschappen en de nutritionele status (7). Er wordt een omgekeerde correlatie gezien van IGF-I met de leeftijd (19). Ook fysieke stimulatie heeft een effect op de IGF-I-levels. Men vindt een verhoging van 27% in serum IGF-I na 10 minuten van matige training in gezonde volwassenen, overeenkomend met veranderingen van 10-28µg/l. Dit is waarschijnlijk IGF-I, vrijgesteld vanuit de skeletspier. Daarom is het moeilijk om 9

19 veranderingen in serum IGF-I als gevolg van spiertraining te onderscheiden van veranderingen ontstaan door exogene toediening (28). In vitro studies hebben aangetoond dat IGF-I een belangrijke bemiddelaar is in alle fasen van de wondgenezing, voornamelijk in de inflammatoire en proliferatieve stadia (29). Er wordt gevonden dat mrna-levels voor IGF-I gestegen zijn na beschadiging van het mediaal collateraal ligament van konijnen (29). Dit effect wordt ook gezien op niveau van de proteïnes ter hoogte van andere pezen (30). De primaire rol van IGF-I is waarschijnlijk het stimuleren van de proliferatie en migratie van fibroblasten en andere cellen naar de plaats van het letsel en vervolgens het verhogen van de productie van collageen en andere extracellulaire matrixstructuren in deze cellen gedurende de fase van remodellering (31). In het geval van skeletspieren toont men aan dat IGF-I proliferatie, differentiatie en hypertrofie induceert in skeletspiercellen. Het heeft ook een bijkomende rol voor het vergemakkelijken van de glucose-instroom in deze cellen (24, 28). IGF-I stimuleert ook osteoblasten in cultuur, om te prolifereren en botmatrixproteïnen te synthetiseren (32). Men heeft gevonden dat de IGF-I concentratie licht gedaald is in L-PRP in vergelijking met de concentratie in het bloedserum (33-35). Synergie met andere molecules is dan ook heel belangrijk voor de stimulerende activiteit van IGF-I. Men heeft aangetoond dat mitogenese van peesfibroblasten het meest werd gestimuleerd door een combinatie van IGF-I samen met het PDGF-BB-isomeer, in vergelijking met het effect van deze 2 groeifactoren (=GF) apart (36). Het kan zijn dat PDGF de IGF-I synthese indirect heeft gestimuleerd (26). Bepaalde in vivo studies bevestigen bovenstaande bevindingen. Kurtz et al. (37) hebben aangetoond dat IGF-I de genezing van geïnciseerde achillespezen in ratten bevordert. Diezelfde studie toont ook aan dat IGF-I inflammatie kan reduceren na het toedienen van een inflammatoir agens carrageenan. Men heeft hier namelijk een kleiner functioneel deficit gevonden bij toediening van IGF-I in vergelijking met de controlegroep. Een RCT van Dahlgren et al. (38) heeft gevonden dat injectie van IGF-I de cel proliferatie, migratie en collageenproductie stimuleert en bijgevolg het herstel van collagenase-geïnduceerde letsels bevordert. Lefaucheur et al. (39) hebben spierletsels in de muis bestudeerd bij het neutraliseren van bfgf, IGF-I en TGF-β d.m.v. antilichamen tegen deze specifieke GF. Er wordt een verminderde helingsrespons waargenomen. Menetrey et al. (40) hebben gevonden dat IGF-I, net als b-fgf het aantal nieuwgevormde myofibres verhoogt in vergelijking met de controlegroep net als het functioneel herstel van een beschadigde spier afkomstig van muizen. Een studie over de rol van IGF in de genezing van fracturen toont aan dat toediening van IGF-I de bot turnover verhoogt in patiënten met een lage botdichtheid (41). Een aantal studies suggereren dat IGF-I een prominente rol speelt in skeletherstel, maar hun resultaten zijn niet conclusief (42). 10

20 2.3.2 VEGF De Vascular endothelial growth factor familie bevat 5 isovormen: VEGF-A, -B, -C, -D, -E en de placenta growth factor (= PIGF) (43). De isovormen zijn een resultaat van alternative splicing van 1 enkel VEGF gen. Ze oefenen elk hun eigen biologische functies uit door het binden op 3 verschillende transmembranaire tyrosine kinase receptoren: VEGFR-1, -2 en -3 (43). De proliferatieve en mitogene activiteit van VEGF hangt voornamelijk af van de interacties met VEGFR-2 (44).De biologische functies van VEGF-A en zijn receptoren VEGFR-1 en -2 zijn het best gekend. Studies hebben aangetoond dat de expressie van VEGF wordt gereguleerd door de hypoxia-inducible factor alpha (Hif1 alpha). Dit promoot de angiogenese en osteogenese door het plaatselijk verhogen van de concentraties van VEGF en osteoblasten (45). Ook GF (46-50) en interleukinen (51) kunnen de expressie van het VEGF gen opreguleren. Verhoogde levels van VEGF in een letsel zijn gecorreleerd met een patroon van vasculaire ingroei vanuit de epi- en intratendineuze bloedvoorziening naar de avasculaire regio ter hoogte van de herstelzone. Deze vascularisatie zorgt voor een aanvoer van cellen, voedingsstoffen en groeifactoren (26). VEGF speelt slechts een kleine rol in de vroeg cellulaire migratie en de vroege proliferatie en is het meest actief gedurende de laat proliferatieve en remodelleringsfase (26, 52). Boyer et al. (53) hebben namelijk gevonden dat de VEGF mrna levels na transsectie van een flexorpees van een hond gelijk blijven van in het begin tot dag 4 na het aanbrengen van dit letsel, terwijl er een sterke stijging optreedt op dag 7 die uiteindelijk daalt tot het zijn normaal niveau bereikt op dag 21. Dit komt overeen met de geobserveerde neovascularisatie rond de herstelzone van de pees na inflammatie. Gelberman et al. (46) hebben namelijk een vergroting van de lengte en densiteit van de bloedvaten in een doorgesneden en vervolgens gerepareerde flexor pees van een hond opgemerkt vanaf dag 3 na de operatie. Dit heeft een piek bereikt op dag 17 met vervolgens een daling in densiteit op dag 28. Een in vivo studie heeft de invloed van een gecontroleerde afgifte van recombinant menselijk VEGF (rhvegf(165)) onderzocht op angiogenese en osteogenese in mandibulaire defecten. Het aanbrengen van dit product leidde tot een intensievere angiogenese en botregeneratie (54). Yoshiaki et al. (55) hebben gevonden dat het toevoegen van VEGF aan een voorste kruisbandreconstructie met behulp van een semitendinosus pees, zorgt voor een meer uitgebreide angiogenese maar tegelijk een verhoogde knielaxiteit met zich meebrengt in vergelijking met de controlegroep. Ook voor de effecten van het VEGF speelt synergie met andere GF een belangrijke rol. Het aanbrengen van TGF-β1 en PDGF op osteoblastculturen induceert een bijkomende VEGF-synthese, wat vervolgens de regeneratieve capaciteit van het botweefsel verhoogt (47, 48). Eenzelfde stijging van VEGF synthese wordt gezien in TGF-β1-toevoeging aan peesweefsel (50). Deze verhoogde synthese wordt ook gevonden bij het aanbrengen van IGF-I op osteoblast-achtige cellen (49). Synergistische effecten van VEGF en HGF, zoals het promoten van overleving van menselijke 11

21 endotheelcellen en tubulogenese in deze cellen, zijn beschreven, hetgeen men niet kan aantonen voor deze 2 GF apart (56). In geactiveerd L-PRP wordt een significante stijging gezien van het aantal groeifactoren waaronder VEGF (x 6,2) in vergelijking met geactiveerd vol bloed (25). Klinisch relevante levels van VEGF werden ook gemeten wanneer L-PRP geactiveerd wordt door collageen type 1 (15). Dit kan eventueel verklaard worden door de aanwezigheid van leukocyten. Deze produceren een grote hoeveelheid VEGF (57). Nochtans is er ook een significant positieve correlatie gevonden tussen de concentratie van trombocyten in het P-PRP en de levels van dit GF (19). Dit werd nogmaals bevestigd door Anitua et al. (17) die hebben aangetoond dat een toevoeging van P-PRP aan menselijke peescellen leidt tot een significante stijging van VEGF en HGF. Er is aangetoond dat een lokale toediening van autoloog L-PRP kan leiden tot een vermindering in serumconcentraties van bepaalde GF zoals EGF. Dit wordt echter niet gezien bij VEGF (58) TFGΒ Transforming growth factor beta is een polypeptide die 3 isovormen heeft: TGF-β1, TGF-β2 en TGFβ3. TGF-β wordt gesynthetiseerd door de meeste cellen betrokken in het genezingsproces maar voornamelijk door bot en trombocyten (26, 59). Deze cytokine kan binden aan 3 verschillende membraanreceptoren: RI, RII en RIII (60). De isovorm TGF-β1 is een multifunctioneel peptide dat proliferatie, differentiatie en andere functies in verschillende celtypes medieert. Het is deze isovorm die het meest wordt gevonden in trombocyten (61). TGF-β heeft gevarieerde effecten, gaande van het stimuleren van celmigratie, de regulatie van proteïnasen, fibronectine bindingsinteracties, terminatie van cel proliferatie via cycline-afhankelijke kinase inhibitoren tot stimulatie van de collageenproductie (12, 26). Het is actief in bijna alle stadia van peesgenezing (62) maar men denkt dat het vooral een belangrijke rol speelt in de initiële inflammatie (26). TGF-βl mrna-expressie is sterk verhoogd kort na het oplopen van een trauma aan een pees. Dit geldt ook voor zijn receptoren die worden opgereguleerd tijdens de genezing van de musculus flexor digitorum profundus bij konijnen (60). Men heeft ook aangetoond dat lactaat, één van de vroegste mediators in wondgenezing wiens concentratie sterk stijgt onder invloed van hypoxie, de TGF-β1-productie in cellen van flexorpezen direct stimuleert (63). Er wordt een vroege stijging gevonden van TGF-β1-levels in de genezende patellapees van ratten. De concentraties van deze GF blijven minstens 8 weken hoog (64). Klein et al. (65) hebben aangetoond dat de 3 isovormen een effect hebben op de collageenproductie en levensvatbaarheid van peescellen. Het aanbrengen van elke isovorm aan cellen in cultuur verhoogt de aantallen van deze cellen. De productie van collageen types I en II is gestegen in alle celtypes hoewel een hogere concentratie van dit GF niet gecorreleerd is met een verdere verhoging van de productie van dit collageentype. Het TGF-β1 kan echter ook negatieve 12

22 effecten uitoefenen op pezen en ligamenten. Chan et al. (66) hebben gezien dat hoge concentraties hiervan de range of motion in pezen significant kan verminderen. Chang et al. (62) hebben ontdekt dat dieren die TGF-β1 antilichamen toegediend krijgen ongeveer een dubbel zo grote range of motion hebben dan de controlegroep. Deze resultaten werden niet gevonden in dieren die zowel antilichamen kregen voor TGF-β1 als β2. De aanwezigheid van TGF-β1 wordt soms geassocieerd met overdreven collageendepositie en vorming van littekenweefsel wat leidt tot beschadiging van mechanische eigenschappen van herstellend weefsel. Men veronderstelt dat het effect van deze groeifactor wordt tegengegaan en gereguleerd door aanwezigheid van andere, door trombocyt gesecreteerde moleculen(19). In het geval van spierletsels vindt men een verminderde genezing bij het wegnemen van TGF-β, IGF-I en bfgf d.m.v. antilichamen gericht tegen deze groeifactoren(39). TGF- β wordt vrijgesteld uit bloedplaatjes tijdens de initiële inflammatoire fase van botheling (42). Zijn effect begint binnen de 24 uren na verwonding en persisteert gedurende ongeveer 10 dagen (67). Wanneer het vrijgesteld wordt door plaatjesdegranulatie of actief gesecreteerd wordt door macrofagen gedraagt TGF- β1 zich als een paracriene groeifactor die proliferatie van fibroblasten, beenmergcellen en pre-osteoblasten beïnvloedt (42). Elk van deze doelcellen is in staat TGF-β-proteïnen te synthetiseren en te secreteren die inwerken op aanliggende cellen op een paracriene manier (68). In pasgeboren muizen gaat een subcutane applicatie van dit GF de angiogenese stimuleren (69). Het TGF-β heeft ook een direct stimulerend effect op de collageensynthese van het bot en vermindert botresorptie door het induceren van apoptose van de osteoclast (70). Verder stimuleert het aanbrengen van TGF-β1 en PDGF op een cultuur van osteoblasten bijkomende VEGF-synthese wat vervolgens de regeneratieve capaciteit van het botweefsel verhoogt (47, 48). Een andere synergistische werking van TGF-β1 met PDGF wordt aangetoond door Boyer et al. (53). Deze onderzoeksgroep heeft in een in vitro onderzoek een positief effect ontdekt van de combinatie van TGF-β1 met het isomeer PDGF-AB op de promotie van fibroblastproliferatie in de voorste kruisband van honden. Dit effect wordt enkel waargenomen in lage dosissen. Er is een significante stijging van de concentratie van TGF-β1 in L- PRP in vergelijking met vol bloed, dit wordt ook gezien wanneer het L-PRP wordt geactiveerd door collageen type I(15, 25, 33) BFGF Basic Fibroblast Growth Factor (= bfgf of FGF2) is een enkelvoudige keten polypeptide, bestaande uit 146 aminozuren en het is een lid van de heparine-bindende GF familie (71). Deze familie bevat 22 leden (43). Deze polypeptiden geven signalen door via FGF-receptoren 1 tot 4 (FGFR1-4). bfgf wordt onder andere vrijgegeven door trombocyten, maar ook door geactiveerde macrofagen in een inflammatoir proces (72). Dat bfgf een rol speelt in wondheling is aangetoond in een studie met 13

23 bfgf-arme muizen (73). Deze muizen vertonen een vertraagde genezing in vergelijking met de controles. Dit wordt beaamd door een andere studie waar de snelheid van re-epithelialisatie van wonden in bfgf-arme muizen gereduceerd is en correleert met een verminderde collageendepositie op de plaats van de wonde (74). Men ziet dat bfgf in verhoogde concentraties aanwezig is in peesletsels (26). Chan et al. (66) hebben een stimulatie van celmigratie en proliferatie door bfgf gevonden in een in vitro studie op gekweekte fibroblasten vanuit een patellapees van een rat. Dezelfde onderzoeksgroep heeft het effect van bfgf in een in vivo studie op de patellapees van ratten onderzocht(75). 7 dagen na de injectie van dit GF in de wonde, ziet men een correlatie tussen de dosis van bfgf en de stijging van collageen type III expressie en cellulaire proliferatie. In de studie van Fukui et al. (76) is een defect in het mediaal collateraal ligament behandeld met verschillende concentraties recombinant menselijk bfgf in een fibrinegel. Het herstel van dit weefsel is postoperatief onderzocht. Men zag dat bfgf de vroege vorming van herstelweefsel bespoedigt in vergelijking met de controlegroep. Een hoge dosis van dit GF zorgt echter voor vertraging in de maturatie, terwijl een lage dosis een gelijkaardige weefselmaturtatie vertoont als het controleweefsel. Verdere observatie heeft ook gewezen op een verminderde type I procollageen expressie in bfgfbehandelde groepen. In de studie van Kobayashi et al. (77) daarentegen is geen significant negatief effect gevonden op de maturatie bij het gebruik van bfgf in een letsel ter hoogte van het anteromediaal deel van de voorste kruisband. De vroege stadia van genezing worden positief beïnvloed. De boost in het begin van de genezing zorgt voor een significant sneller en effectiever vervolg in de latere fasen van genezing. De resultaten van deze 2 onderzoeken komen niet overeen, dit kan het gevolg zijn van het gebruik van 2 verschillende modellen van aangebrachte laesies. Er is ook aangetoond dat FGF een neurotrofische activiteit bevat (78). bfgf kan interageren met andere GF om synthese en secretie van het nerve growth factor (= NGF) te stimuleren (79). Dit kan belangrijk zijn in het reïnnervatieproces van een regenererende spier (22). Menetrey et al. (40) hebben het gebruik van bfgf in een genezende spier bestudeerd. Dit is geïnjecteerd in laceraties van de gastrocnemius spier van de muis. Er zijn regenererende myofibres teruggevonden over het volledige oppervlakte van de laceratie in tegenstelling tot de controlegroep waar deze myofibres enkel in het diepe deel van de laceratie worden teruggevonden. Een maand na de verwonding zijn de spieren behandeld met bfgf sterker dan de spieren in de controlegroep. Efthimiadou et al. (80) hebben ontdekt dat FGF de angiogenese in genezende gastrocnemiusspieren in de rat verhoogt. Zoals hierboven reeds is vermeld, hebben Lefaucheur et al. (39) een verminderde helingsrespons aangetoond in spierletsels in de muis waar antilichamen tegen bfgf, IGF-I en TGF-β1 werden aangebracht. Andere studies tonen aan dat het bfgf ook een rol speelt in botregeneratie. bfgf heeft een prolifererend en differentiërend effect op stromale beenmergcellen in ratten (81). De rol van bfgf in inductie van botregeneratie is ook aangetoond in een studie die de genezing van alveolaire botdefecten 14

24 in honden bestudeert. Er werd is significant hogere concentratie aan regenererend bot gevonden ter hoogte van alveolaire defecten behandeld met bfgf in tegenstelling tot de controleplaatsen (82) PDGF Platelet-derived growth factors (= PDGF) zijn polypeptiden bestaande uit 2 peptideketens, namelijk een α-keten en/of een β-keten die met elkaar verbonden zijn d.m.v. disulfidebindingen. Er bestaan 3 actieve isovormen, namelijk αα, ββ en αβ en 2 soorten receptoren: PDGFRα en PDGFRβ (61). De isovormen worden in sommige studies ook aangeduid met hoofdletters: AA, BB en AB (70). In trombocyten is ongeveer 70% van het aanwezige PDGF een AB dimeer en het grootste deel van de overige 30% is een BB-dimeer (83). De PDGF concentratie is sterk gestegen in genezende pezen, dit suggereert dat PDGF een rol speelt in het genezingsproces (84). Men denkt dat dit GF voornamelijk in de vroege stadia van genezing belangrijk is om de synthese van andere GF zoals IGF-I te induceren, eveneens induceert het een opregulatie van IGF receptoren (85). PDGF gaat mesenchymale cellen, zoals osteoblasten en fibroblasten, aanzetten tot mitose (86). Het stimuleert replicatie van osteoblasten en als gevolg van het toenemend aantal cellen zal ook de collageensynthese indirect gestimuleerd worden. PDGF heeft geen effect op de differentiatie van deze cellen, maar zal wel het aantal osteoclasten laten toenemen met botresorptie en een snellere remodellering van het bot tot gevolg (70). Het is een chemoattractant en een activator van neutrofielen, monocyten en fibroblasten. Het verhoogt de synthese van fosfolipiden, cholesterolesters, glycogeen en prostaglandines (87). Hildebrand et al. (88) heeft geen synergistisch effect gevonden van PDGF-BB met TGF-β1 in de genezing van het mediaal collateraal ligament in een konijn. De combinatie van deze 2 GF is hier zelf de oorzaak van een slechtere genezing in vergelijking met de behandeling van PDGF-BB alleen. Letson en Dahners (89) hebben ook geen synergistische effecten gevonden tussen PDGF en IGF-I of bfgf bij de genezing van het mediaal collateraal ligament in ratten, maar negatieve effecten zijn ook niet geobserveerd. De behandeling van PDGF alleen of in combinatie met IGF-I of bfgf zorgt voor een significante stijging in de sterkte en de stijfheid van dit ligament. Tsuzaki et al. (36) hebben wel een synergistisch effect tussen IGF-I en PDGF-BB aangetoond. Mitogenese wordt het sterkst gestimuleerd door de aanwezigheid van een combinatie van deze groeifactoren. Het PDGF induceert bijkomende VEGF-synthese in osteoblasten (47, 48). Met betrekking tot spiercellen is enkel de isovorm PDGF-BB een significante promotor van proliferatie en inhibitor van differentiatie (90). Nadat PDGF wordt vrijgesteld uit beschadigde bloedvaten, trombocyten en macrofagen stimuleert het de angiogenese (91). Verder helpt het ook in de 15

25 migratie van precursorcellen van de spier (92). De concentratie aan PDGF is sterk gestegen in geactiveerd L-PRP in vergelijking met de concentratie in vol bloed (33, 93) 2.4 GENEZINGSPROCES PEES Pezen verbinden spieren met het skelet en zorgen dat de kracht van de contractie van een spier wordt overgezet naar het bot. Pezen bestaan voornamelijk uit water en collageen type 1 met kleine hoeveelheden van andere collageentypes, matrixmaterialen en verschillende types cellen, zoals fibroblasten. Pezen genezen relatief traag in vergelijking met andere bindweefsels, een reden hiervoor is een povere vascularisatie (94). Het herstelproces van beschadigde pezen is afhankelijk van het vermogen van tenocyten om te prolifereren en extracellulaire matrix (= ECM) bestaande uit collageen en proteoglycanen te produceren (33). Hoewel de meeste pezen spontaan genezen na een letsel is het gevormde littekenweefsel mechanisch inferieur en kan daarom minder goed de functies van een normale pees uitvoeren. Bijgevolg is het vatbaarder voor bijkomende schade (95). Het proces van de peesgenezing volgt een patroon dat vergelijkbaar is met andere genezende weefsels. Eerst is er de inflammatoire fase waarin een trauma het weefsel beschadigt: bloedvaten scheuren en intrinsieke cellen geven signalisatiemolecules vrij die vervolgens de stollingscascade gaan activeren. Dit leidt tot klonterformatie rond de beschadigde zone. De klonter bevat cellen en trombocyten die onmiddellijk een grote waaier aan moleculen vrijgeven, voornamelijk GF zoals PDGF, TGFβ en IGF- I. Zij veroorzaken een acute lokale inflammatie. Tijdens deze inflammatoire fase is er een invasie van extrinsieke cellen, zoals neutrofielen en macrofagen, die de necrotische debris van fagocytose opruimen en samen met intrinsieke cellen, zoals endotenon en epitenon cellen een 2 de batterij aan cytokines produceren om de reparatieve fase te initiëren (26). In deze reparatieve fase is er collageendepositie en vorming van granulatie weefsel, neovacularisatie, migratie van de extrinsieke fibroblasten en proliferatie van de intrinsieke fibroblasten. Deze fibroblasten zijn verantwoordelijk voor synthese van de nieuwe extracellulaire matrix die voornamelijk bestaat uit collageen en glycosaminoglycanen. Ten laatste is er de remodelleringsfase met vermindering van de cellulaire en vasculaire inhoud van het littekenweefsel en vermeerdering van collageen type 1, zowel qua inhoud als densiteit. Uiteindelijk zal het collageen meer georganiseerd worden en gecrosslinked met het weefsel buiten de traumazone. 16

26 Eénmaal het genezingsproces compleet is, zal de cellulariteit, de vasculariteit en het collageen evolueren naar een zo normaal mogelijke pees, hoewel de diameter en cross-linking van de collageenfibrillen vaak toch inferieur blijven (96). Dit mechanisch inferieur herstelweefsel is zwakker en gevoeliger voor blijvende elongatie dan een niet-verwonde pees en heeft daarom een hoger risico op verdere schade. De bovenstaande beschrijving van de genezing van een pees is vrij algemeen. Het is belangrijk te weten dat er kleine verschillen zijn in de genezing van andere soorten pezen, zoals bijvoorbeeld extrasynoviale en intrasynoviale pezen. Extrasynoviale pezen kunnen makkelijk beïnvloed worden door groeifactoren en cytokines die geproduceerd worden door extrinsieke cellen, terwijl intrasynoviale pezen meer moeten vertrouwen op intrinsieke cellen. Deze verschillen zijn waarschijnlijk het gevolg van een andere lokale omgeving en het gemak waarmee de noodzakelijke GF de beschadigde zone kunnen bereiken (97). Toch wordt de genezing van de meest types pezen zowel door extrinsieke als intrinsieke cellen beïnvloed (63) SPIER Het genezingsproces van een spier bestaat uit 3 fasen. Eerst en vooral is er destructie met vorming van een hematoom, necrose van het beschadigd spierweefsel, degeneratie en een inflammatoire celreactie. De tweede fase is de herstelfase. Deze fase bestaat onder meer uit de fagocytose van beschadigd weefsel, de regeneratie van dwarsgestreept spierweefsel, de aanmaak van littekenweefsel en de neovascularisatie. De regeneratie van spiervezels begint met de activatie van myogene precursorcellen, ook wel satellietcellen genaamd. Deze bevinden zich tussen de lamina basalis en het plasmamembraan van elke spiervezel. Zij prolifereren en differentiëren in veelkernige myotubes en vormen uiteindelijk de spiervezels. Vele myoblasten kunnen fuseren met bestaande genecrotiseerde spiervezels en zijn soms in staat verdere degeneratie van deze vezels te voorkomen (98). Tegelijkertijd gaan fibroblasten de scheur invaderen en produceren zij extracellulaire matrix om het netwerk van bindweefsel te herstellen (99). De fysiologische rol van dit bindweefsel is de kracht over het defect heen te brengen om zo het beschadigde lidmaat reeds te kunnen gebruiken voor er een volledig herstel heeft plaatsgevonden (40). Bij uitgebreide weefselschade kan proliferatie van fibroblasten leiden tot overvloedige productie van dens littekenweefsel, wat op zijn beurt een onvolledig herstel als gevolg kan hebben (100). In de laatste fase, de remodelleringsfase, gaat het nieuw aangemaakte spierweefsel matureren en contraheren met een herstructurering van het littekenweefsel. 17