Histologische, biochemische en biomoleculaire effecten van pulsed dye laser op de huid.

Transcriptie

1 Academiejaar Histologische, biochemische en biomoleculaire effecten van pulsed dye laser op de huid. Charlotte NAEYAERT Promotor: Prof. Dr. J. Lambert Co-promotor: Dr. E. Verhaeghe Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot MASTER IN DE GENEESKUNDE

2

3 Academiejaar Histologische, biochemische en biomoleculaire effecten van pulsed dye laser op de huid. Charlotte NAEYAERT Promotor: Prof. Dr. J. Lambert Co-promotor: Dr. E. Verhaeghe Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot MASTER IN DE GENEESKUNDE

4 De auteur en de promotor geven de toelating dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk. Datum: 06/05/2011 Charlotte Naeyaert Dr. E. Verhaeghe Prof. Dr. J. Lambert

5 Voorwoord Deze masterproef kon slechts tot stand komen dankzij de hulp van een aantal mensen. In de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. Dr. J. Lambert bedanken, voor de kritische reflectie en het nalezen van deze masterproef. Bijzondere dank gaat uit naar mijn co-promotor Dr. E. Verhaeghe die mij gedurende deze twee jaar telkens opnieuw bijgestaan heeft. Zij stond in voor het aanreiken van het onderwerp, het verstrekken van informatie en de kritische evaluatie van de tekst. Onze samenwerking heeft geleid tot de realisatie van dit werk.

6 Inhoudstafel 1. Abstract Inleiding Mechanisme van laser Classificatie van lasers Optische eigenschappen van weefsel Selectieve fotothermolyse Pulsed dye laser Laserparameters Weefselkoeling Gebruik Complicaties Niet-ablatieve lasertherapie Structuur van de huid Epidermis Dermis Hypodermis Wondgenezing Inflammatiefase Proliferatiefase Maturatiefase Methodologie Resultaten Diermodel Varkenshuid als model voor humane huid Muismodel Konijnenhuid als model voor cutane vasculaire letsels In vitro model Effect van PDL op humane fibroblasten van normale huid... 20

7 4.2.2 Effect van PDL op keloïdfibroblasten in vitro Normale huid Immunologische activiteit van de pulsed dye laser Invloed van PDL op collageenproductie Invloed van energiedensiteit en overlappende laserpulsen bij PDL-therapie Pathologische huid Zonbeschadigde huid Acne vulgaris Keloïd Psoriasis Wijnvlek, naevus flammeus of port wine stains (PWS) Discussie Dierstudies In vitro studies Humane huid Pathologische huid Zonbeschadigde huid Acne Keloïd PWS Conclusie Referentielijst... 48

8 Lijst met afkortingen CW KTP-laser APTD-laser Nd:YAG laser TRT GAG ECM PDEGF TGF EGF MMP MT-MMP TIMP RECK UV-licht PDL FPDL Er:YAG KM muizen H&E- kleuring CVL CSC TUNEL-assay RT-PCR SMAD TNF IL MCR MAP-kinase AP ERK JNK PCNA VEGF PASI-score Continuous waves Kalium-titanyl-fosfaatlaser Argon pumped tunable dye laser Neodymium: yttriumaluminiumgarnet laser Thermale relaxatietijd Glycosaminoglycanen Extracellulaire matrix Platelet derived endothelial cell growth factor Transforming growth factor Epidermal growth factor Matrixmetalloproteïnasen Membraantype matrixmetalloproteïnasen Tissue inhibitor of metalloproteïnase Reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs Ultraviolet licht Pulsed dye laser Flashlamp pumped pulsed dye laser Erbium:yttrium-aluminium-garnet laser Kunming muizen Haematoxyline-eosine-kleuring Cutane vasculaire letsels Cryogen spray cooling Terminaal deoxynucleotidyl transferase- mediated dutp Nick-End Labeling assay Reverse transcriptase-polymerase chain reaction Small Mothers against decapentaplegic Tumor necrosis factor Interleukine Melanocortinereceptor Mitogen activated kinase Activator protein Extracellular signal-related kinase c-jun N-terminaal kinase Proliferating cell nuclear antigen Vascular endothelial growth factor Psoriasis Area and Severity Score

9 PWS DEJ EM IF Port wine stain Dermo-epidermale junctie Elektronenmicroscopie Immunofluorescentie

10 1. Abstract Achtergrond: De pulsed dye laser (PDL) berust op het principe van selectieve fotothermolyse. Deze theorie beschrijft de mogelijkheid om doelgericht chromoforen te vernietigen zonder collaterale thermale schade aan te richten. PDL is de gouden standaard voor de behandeling van capillaire vasculaire malformaties. Ook tal van niet-vasculaire letsels worden behandeld met PDL. Deze nonablative laser stimuleert dermale remodelling en collageenproductie, maar het exacte moleculaire mechanisme hiervan is nog niet gekend. Doelstelling: In deze literatuurstudie wil men nagaan wat er gekend is rond de histologische, biochemische en biomoleculaire effecten van pulsed dye lasertherapie op de huid. Men gaat na of deze gegevens inderdaad een verklaring bieden voor de beschreven klinische effecten van pulsed dye laser. Methoden: Er werd een literatuurstudie uitgevoerd aan de hand van artikels gevonden via de databanken PubMed en Isi Web of Science. De besproken artikels zijn gepubliceerd tussen 1981 en Er werd een onderscheid gemaakt tussen studies uitgevoerd op dieren, in vitro, op normale huid en op pathologische huid. Resultaten: Nonablative pulsed dye lasertherapie induceert mogelijks veranderingen in verschillende moleculen betrokken in de remodelling van de extracellulaire matrix. De meeste studies tonen een toename van de collageenproductie in de dermis met vooral inductie van type I procollageen mrna. Ook de inductie van type III procollageen, verscheidene matrixmetalloproteïnasen en primaire cytokines wordt aangetoond. PDL heeft niet alleen effect via het principe van selectieve fotothermolyse, maar heeft ook een immunologische activiteit. Men vermoedt dat TGF-β het onderliggend moleculair mechanisme is van de PDL bij de behandeling van zowel zonbeschadigde huid als van inflammatoire acne. Conclusie: De klinische relevantie van deze histologische, biomoleculaire en biochemische effecten is nog niet duidelijk onderzocht. De studies bevatten verschillende beperkingen. De resultaten zijn vaak gebaseerd op slechts één enkele behandeling met de PDL. Dikwijls zijn ze uitgevoerd op een te kleine patiëntenpopulatie en in een te kort tijdsbestek. Bovendien worden verschillende parameters gebruikt als maat voor neocollagenese waardoor het moeilijk is om de resultaten met elkaar te vergelijken. 1

11 2. Inleiding 2.1 Mechanisme van laser De term laser is een acroniem voor light amplification by stimulated emission of radiation. Het fenomeen gestimuleerde emissie werd al door Einstein voorspeld, maar kon pas in de jaren 60 experimenteel bewezen worden. Het principe van gestimuleerde emissie is te begrijpen aan de hand van het begrip spontane emissie en de kwantummechanica van materie. Atomen (of moleculen) bestaan uit een kern omgeven door orbitale elektronen. Ieder elektron kan een aantal energieniveaus hebben: de grondtoestand E1 en de aangeslagen toestanden E2, E3, In deze aangeslagen toestanden bezitten de elektronen een hogere energie. Door absorptie van een foton met net zoveel energie als het energieverschil tussen de twee toestanden, kan het elektron overgaan naar een hogere toestand. Het elektron bevindt zich na absorptie in de geëxciteerde toestand en kan terugvallen naar een lager energieniveau. Deze terugval gaat gepaard met emissie van een foton met golflengte λ en energie gelijk aan het energieverschil tussen de twee toestanden. Dit proces heet spontane emissie (2). Gestimuleerde emissie ontstaat door een interactie tussen het foton en een elektron dat reeds in de geëxciteerde toestand zit. Vermits het elektron al geëxciteerd is, kan het geen foton meer absorberen. Toch geeft deze interactie ook aanleiding tot een emissiereactie waarbij het deeltje terugvalt naar een lager niveau en een foton uitzendt (Figuur 1). In dit proces worden er dus twee fotonen uitgestraald met dezelfde golflengte, richting en fase: het invallende foton en het nieuwe foton dat ontstaan is door de terugval van het geëxciteerde elektron. Deze interactie versterkt dus de intensiteit van het invallend licht (1;2). De energie die nodig is voor dit proces wordt aan de laser geleverd vanuit een externe krachtbron. Bij herhaling van dit proces, neemt het aantal fotonen in de laser gestadig toe. Wanneer het aantal geëxciteerde elektronen groter is dan het aantal elektronen in de grondtoestand, spreekt men van een populatie-inversie. Voor de gewenste werking van laser is het nodig dat deze populatie-inversie gecreëerd wordt en in stand gehouden wordt. Versterking van het licht treedt immers enkel op wanneer er meer gestimuleerde emissie is dan absorptie, dus wanneer er meer geëxciteerde elektronen zijn dan elektronen in de grondtoestand (2). Figuur 1: Gestimuleerde emissie (1) 2

12 Laserlicht heeft een aantal eigenschappen waardoor het zich onderscheidt van licht dat uitgezonden wordt door conventionele lichtbronnen (1;3): Laserlicht is in de eerste plaats monochromatisch. Alle uitgezonden lichtgolven hebben slechts één golflengte in overeenstemming met het energieverschil tussen de geëxciteerde toestand en het niveau waarop het elektron terugvalt na emissie. De golflengte van de laserstraal laat selectieve absorptie toe door chromoforen in de huid. Daarnaast heeft de gestimuleerde emissie ook tot gevolg dat laserlicht coherent is: alle stralen zijn in fase zowel in plaats als in tijd. Ook sturen lasers een relatief smalle bundel uit. De stralen lopen parallel met elkaar zodat ze over een lange afstand kunnen doordringen in het weefsel zonder te divergeren. Het gecollimeerde licht kan gefocusseerd worden in kleine spots. Dit maakt zeer lokale vernietiging mogelijk. 2.2 Classificatie van lasers In 1959 introduceerde Maiman de eerste laser met een cutane applicatie. Het was een robijnlaser die rood licht uitstuurde met een golflengte van 694 nm. Daarna werden nog verschillende lasers op de markt gebracht. Er zijn verschillende manieren om lasers te classificeren: 1. Volgens golflengte: We maken een onderscheid tussen lasers die ultraviolet (UV) licht ( nm) uitzenden, lasers die zichtbaar licht ( nm) emitteren en lasers waarvan de uitgezonden golflengte in het infraroodgebied (>780 nm) ligt (Figuur 2). 2. Volgens het type geëmitteerde golven: continue golven (CW), quasi-continue golven (quasi- CW) of gepulseerde golven (2-4): CW lasers emitteren een constante lichtstraal met een lange pulsduur. Dit resulteert in niet-selectieve beschadiging van het weefsel. De CO 2 -laser en de argonlaser zijn voorbeelden van CW-lasers (2-4). Bij de quasi - CW lasers is de lichtstraal in verschillende korte segmenten verdeeld waardoor er constante hoeveelheden laserenergie onderbroken worden uitgezonden. Voorbeelden van dergelijke quasi-cw lasers zijn de kalium-titanyl-fosfaatlaser (KTP), krypton, argon pumped tunable dye lasers (APTD), copper vapor en de copper bromidelaser (3;4). De gepulseerde lasersystemen zenden hoogenergetische laserstralen uit met zeer korte pulsduur met lange pauzes tussen elke puls (0,1-1 seconde) (4). Deze gepulseerde systemen kunnen ofwel long-pulsed ofwel short-pulsed zijn. De pulsed dye laser (PDL) is een voorbeeld van een long-pulsed laser met een pulsduur variërend van 450 tot 1500 microseconden. Short-pulsed lasers zoals de Quality-Switched (QS) ruby, alexandrite of de neodymium (Nd): yttriumaluminiumgarnet (YAG) lasers hebben een pulsduur die 3

13 varieert tussen 50 en 100 nanoseconden. De gepulseerde en quasi-continue lasersystemen zijn ten opzichte van de CW-lasers beter afgestemd op huidlaserchirurgie gebaseerd op het principe van selectieve fotothermolyse. De thermale relaxatietijden (TRT) van de meeste chromoforen zijn immers zeer kort. Om thermale schade van de huid te vermijden moet de pulsduur gelijk of korter zijn dan de TRT van het chromofoor (2-4). 3. Volgens het ablatieve versus non-ablatieve vermogen van de laser. Deze classificatie wordt hoofdzakelijk gebruikt binnen het domein van de photorejuvenation (2). 4. Volgens het medium in de optische caviteit waarin het laserlicht opgewekt wordt. Dit medium kan een gas, vloeistof, kristal of halfgeleider zijn en bepaalt de golflengte die de laser uitzendt. Bij PDL is het actief medium een complexe organische kleurstof, zoals rhodamine (2). Figuur 2: Emissiespectra van lasers Figuur 3: Absorptiespectra van weefselchromoforen (5) 2.3 Optische eigenschappen van weefsel Een laserbehandeling op de huid kan gepaard gaan met absorptie, reflectie, transmissie en verstrooiing van het licht: Volgens de wet van Grotthus-Draper moet licht geabsorbeerd worden door het weefsel om enig klinisch effect te verkrijgen. De geabsorbeerde energie wordt uitgedrukt in J per cm 2 en wordt ook de energiedensiteit of fluence genoemd. De hoeveelheid energie die geabsorbeerd wordt, is afhankelijk van het chromofoor dat aanwezig is in de huid. Het chromofoor is het gedeelte van de molecule dat licht van een bepaalde golflengte opvangt en absorbeert. De gebruikte golflengte moet overeenstemmen met de absorptiekarakteristieken van het chromofoor. De belangrijkste endogene chromoforen in de huid zijn melanine, hemoglobine en water. Tatoeage-inkt is een voorbeeld van een exogeen chromofoor. Het absorptiespectrum van melanine bevat ultraviolet licht (UV) en zichtbaar licht met een afnemende absorptie voor infrarood. Hemoglobine heeft een maximale absorptie voor 4

14 UVA, blauw licht (400 nm), groen licht (541 nm) en geel licht (577 nm). De absorptie van collageen ligt in het zichtbaar licht en near - infraroodspectrum. Water absorbeert goed infraroodstraling (4). Verstrooiing van het licht is minimaal in de epidermis, maar neemt toe in de dermis door de aanwezigheid van collageenvezels. Deze zijn grotendeels verantwoordelijk voor de lichtverstrooiing in de huid. De mate waarin het licht verstrooid wordt, is omgekeerd evenredig met de golflengte van het licht. Hoe groter de golflengte, hoe dieper de golven zullen penetreren in het weefsel en hoe minder het licht verstrooid wordt. Verstrooiing reduceert de energiedensiteit die kan geabsorbeerd worden door het chromofoor en kan daardoor het klinisch effect van de laser verminderen (4). Reflectie en transmissie van het licht zijn minder belangrijk met het oog op het bekomen van een klinisch effect op de huid. Ter hoogte van het stratum corneum wordt 4-6% van het licht gereflecteerd. Residueel licht wordt doorgegeven aan subcutaan weefsel. Deze transmissie is afhankelijk van de golflengte. Langere golflengten penetreren dieper dan kortere golflengten omdat ze minder verstrooid worden (4). 2.4 Selectieve fotothermolyse Pulsed dye lasertherapie is gebaseerd op het principe van selectieve fotothermolyse, een concept dat in 1983 werd ontwikkeld door Anderson en Parrish (6). Deze theorie beschrijft de mogelijkheid om doelgericht weefsels (chromoforen) te vernietigen zonder thermale schade te berokkenen aan de omliggende normale structuren. Om aan het principe van selectieve fotothermolyse te voldoen, zijn drie eigenschappen van het laserlicht van belang: Golflengte Pulsduur Energiedensiteit Deze laserparameters dienen voor elke toepassing aangepast te worden om maximaal gecontroleerde destructie te bekomen van het chromofoor met zo min mogelijk collaterale thermale schade (2). Allereerst moet een geschikte golflengte bepaald worden die selectief geabsorbeerd wordt door het chromofoor. Deze golflengte moet zo gekozen worden zodat er een groot verschil bestaat tussen de absorptiecoëfficiënt van het chromofoor en het omgevende weefsel. Sommige golflengten laten specifieke absorptie toe van chromoforen in de huid (2). Ten tweede moet de expositieduur van het weefsel aan het laserlicht of de pulsduur korter zijn dan de TRT van het weefsel. De TRT is de tijd die nodig is om het weefsel af te koelen met 63% van de piektemperatuur onmiddellijk na irradiatie. Op deze manier kunnen we de hoeveelheid energie die op de huid inwerkt beperken en oververhitting van de epidermis en dermis vermijden. Dit zorgt immers voor blaarvorming, depigmentatie en littekenvorming (7). 5

15 Absorptiecoëfficiënt Tot slot moet de energiedensiteit (fluence) per oppervlakte-eenheid (J/cm 2 ) voldoende hoog zijn om het doelorgaan te beschadigen en de expositieduur van het doelwitchromofoor zo laag mogelijk te houden (2). 2.5 Pulsed dye laser Laserparameters De pulsed dye laser (PDL, flashlamp-pumped PDL, V-Beam, N-lite) was in 1989 de eerste laser die uitging van het principe van de selectieve fotothermolyse. De eerste PDL emitteerde laserlicht van 577 nm in overeenstemming met het absorptiespectrum van oxyhemoglobine (418, 542, 577 nm). Door selectief in te werken op oxyhemoglobine en in mindere mate op desoxyhemoglobine kan het omliggende bloedvat voldoende energie absorberen (Figuur 3). Conversie van energie naar warmte (fotothermisch effect) zorgt voor coagulatie van het bloedvat. PDL werd dan ook snel de voorkeursbehandeling voor verschillende vasculaire letsels (8). Later werd de golflengte aangepast tot 585 nm waardoor de penetratiediepte in de dermis groter werd met behoud van de vasculaire specificiteit. De huidige pulsed dye lasers emitteren een golflengte van 585 of 595 nm met een langere pulsduur. De penetratiediepte van een golflengte van 595 nm is groter dan deze van 585 nm, maar de absorptie door oxyhemoglobine is lager voor een golflengte groter dan 585 nm. Om deze verminderde absorptie te compenseren wordt de energiedensiteit verhoogd met 20-50% (4) nm Green nm Yellow Red & Near-Infrared nm Alexandrite Golflengte (nm) Figuur 3: Absorptiespectrum van hemoglobine en melanine 6

16 We gebruiken een energiedensiteit tussen 3 en 10 J/cm 2 en een spotsize van 2 tot 10 mm met niet meer dan 10% overlap tussen de verschillende pulsen om thermale schade tot een minimum te beperken. Over het algemeen worden er enkel lagere energiedensiteiten gebruikt bij kinderen en op delicate plaatsen vb. infraorbitaal. Soms is een grotere spotsize nodig om te kunnen penetreren in grotere en dieper gelegen bloedvaten vb. perinasaal (2). Met een pulsduur (450 microseconden) die korter is dan de thermale relaxatietijd (TRT) van kleine en middelgrote bloedvaten (1 milliseconde) is de PDL in overeenstemming met het principe van de selectieve fotothermolyse. De PDL slaagt er dan ook in om selectief bloedvaten te beschadigen zonder thermale schade te berokkenen aan het omliggende weefsel (2) Weefselkoeling In de meeste pulsed dye lasersystemen bouwde men een koelingssysteem in omdat het absorptiespectrum van oxyhemoglobine deels overlapt met dat van melanine dat vooral aanwezig is in haarfollikels en de epidermis. Absorptie van energie door melanine produceert warmte in de epidermis. Oververhitting van de epidermis kan resulteren in blaarvorming, depigmentatie of littekenvorming en is vooral een risico bij gepigmenteerde huid. Om deze neveneffecten te vermijden maakt men gebruik van een epidermaal koelingssysteem. Bovendien reduceert epidermale koeling het risico op postoperatieve complicaties zoals epidermale schade en verandering van de pigmentatie en zal ook de pijn waarmee de behandeling gepaard gaat verminderen. Het gebruik van een koelingssysteem laat toe om met hogere energiedensiteiten te werken waardoor de behandeling doeltreffender wordt (3;4) Gebruik De introductie van de pulsed dye laser betekende een enorme evolutie in de behandeling van vasculaire letsels. PDL wordt dan ook beschouwd als de laser bij uitstek om de meeste benigne congenitale en verworven vasculaire letsels te behandelen. PDL is voor vasculaire letsels superieur qua doeltreffendheid en bovendien houdt het weinig risico s in. Het is de gouden standaard voor de behandeling van capillaire vasculaire malformaties (CVM) of wijnvlekken. Deze laser werd bovendien al meermaals succesvol gebruikt voor de behandeling van faciale telengiëctasieën, hemangiomen, granuloma pyogenicum, Kaposi sarcoom en poikiloderma van Civatte (9). Naast vasculaire letsels zijn er ook rapporten van andere huidaandoeningen die met PDL behandeld werden waaronder hypertrofische littekens en keloïd, striae distensiae, wratten, angiofibromen, lymfangiomen, het syndroom van Goltz, multiple eccriene hidrocystoma, lupus pernio, lupus erythematosis, inflammatoire lineaire verruceuze epidermale naevi, atrophoderma vermiculata, granuloma faciale, necrobiosis lipoidica diabeticorum, xanthelasmata, elastosis perforans serpiginosa, hyperplasie van de sebumklieren en molluscum contagiosum (3;4;10). 7

17 Ook in het kader van huidveroudering en zonbeschadiging werd een gunstig effect op de huidtextuur beschreven met PDL. Dermale remodelling is het proces waarbij beschadigde en verouderde proteïnen in de huid vervangen worden door nieuwe collageen- en elastinevezels. Dit herstelt de elasticiteit van de huid, verwijdert rimpels en doet littekens vervagen (11) Complicaties Postoperatief oedeem en purpura zijn vaak bijwerkingen van de behandeling van PDL. Purpura ontstaat door extravasatie van rode bloedcellen uit bloedvaten die blootgesteld werden aan irradiatie. Blaarvorming of korstvorming worden zelden gezien na PDL therapie. Voornamelijk bij patiënten met een gepigmenteerde huid zien we na radiatie een verandering van de pigmentatie van de huid door interactie met het epidermale melanine. Zowel hyper- als hypopigmentatie kunnen optreden. Littekenvorming is zeldzaam als complicatie van PDL (3;8). Deze bijwerkingen zijn afhankelijk van de locatie, de gebruikte energiedensiteit, het huidtype van de patiënt en de pulsduur. 2.6 Niet-ablatieve lasertherapie De laatste jaren werden nog verschillende andere nonablative lasers ontwikkeld met het oog op het behandelen van rimpels, littekens en zonbeschadigde huid. Met deze lasers tracht men de huid te verjongen. Dit proces wordt photorejuvenation genaamd. Traditionele behandelingsmethodes zoals chemische peeling, dermabrasie of laserresurfacing met de CO 2 -laser of de erbium:yttrium-aluminium-garnet laser (Er:YAG) zijn gebaseerd op het afschaven van de epidermis, beschadigen van de dermis en de daaropvolgende collageenproductie en remodelling van de extracellulaire matrix. Deze ablatieve methodes zijn klinisch effectief, maar gaan gepaard met een langdurig herstel om de groei van nieuw epitheel en oppervlakkige dermis mogelijk te maken. Bovendien is het risico op infectie, littekenvorming en dispigmentatie groot (2). Met de nonablative lasers probeert men neocollagenese in de dermis te stimuleren zonder daarbij de bovenliggende epidermis te beschadigen. Deze methode geeft minder bijwerkingen en wordt minder onaangenaam geacht voor de patiënt. Er is slechts minimaal of geen herstel nodig na nonablative resurfacing omdat de bovenliggende epidermis niet beschadigd wordt. Het juiste werkingsmechanisme van de niet-schavende lasertechniek is nog niet gekend. Men veronderstelt dat door absorptie van de energie, uitgezonden door de nonablative laser, de dermis specifiek beschadigd wordt. Deze beschadiging brengt een wondhelingsproces op gang en induceert bovendien collageenproductie en dermale remodelling. De initiële cytokinestimulus die hiervoor verantwoordelijk is, is onbekend. Verschillende lasers worden gebruikt voor nonablative therapie waaronder ook de pulsed dye laser (11-13). 8

18 2.7 Structuur van de huid De huid bestaat uit drie lagen, van buiten naar binnen, epidermis, dermis en subcutis of hypodermis. Tussen de epidermis en de dermis ligt de basale membraan. De huidaanhangsels of adnexa zijn de haren, zweetklieren, talgklieren en nagels (9) Epidermis De epidermis is een meerlagig verhoornd plaveiselepitheel dat opgebouwd wordt door keratinocyten. Hoewel de epidermis zeer dun is (0,1 mm) wordt ze nog eens onderverdeeld in vier lagen. Deze vier lagen vertegenwoordigen de verschillende stadia van celmaturatie. De cellen delen zich in de onderste cellaag en migreren naar boven toe waarbij ze degeneratieve veranderingen ondergaan (9;14). Het stratum basale is door herhaalde mitotische celdelingen verantwoordelijk voor de constante regeneratie van de andere lagen van de epidermis. De basale cellaag bestaat hoofdzakelijk uit keratinocyten. De cellen bevatten keratinetonofibrillen en zijn met hemidesmosomen aan de basale membraan vastgehecht. Melanocyten vormen 5-10% van de basale celpopulatie. Deze pigmentvormende cellen liggen tussen de basale cellen en hebben celuitlopers tot in het stratum spinosum (9;14). Het stratum spinosum (stratum van Malpighi) is genoemd naar de intercellulaire desmosomen die op lichtmicroscopisch beeld als stekels voorkomen. Naarmate de cellen verder opschuiven naar de oppervlakte synthetiseren ze keratohyaline. Tussen de keratinocyten worden langerhanscellen teruggevonden die deel uitmaken van het immuunsysteem en een belangrijke rol spelen in antigenpresentatie (9;14). In de granulaire cellaag (stratum granulosum) platten de keratinocyten progressief af naar de oppervlakte toe. Het cytoplasma bevat granules gevormd door confluerende keratohyalinedruppels. Aan de oppervlakte verliezen deze granulaire cellen hun kern en cytoplasma, waardoor enkel het gevormde keratine overblijft (9;14). Het stratum corneum is het eindstadium van de maturatie van de keratinocyten en is de eigenlijke bescherming tegen invloeden van buitenaf. De celstructuren zijn onherkenbaar en de nucleï zijn verdwenen. Het cytoplasma van deze corneocyten is bijna volledig gevuld met keratine. De afgeplatte dode cellen schilferen makkelijk af en worden vervangen door de vorming van nieuwe cellen (9;14) Dermis De dermis is het steunweefsel van de huid dat bestaat uit een matrix waarin vezels en cellen voorkomen. De matrix of grondstof van de huid is opgebouwd uit hyaluronzuur en andere gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG s) die voor de viscositeit en hydratatie van de huid zorgen. In de dermis zijn chondroïtinesulfaat, dermataansulfaat en hyaluronzuur de belangrijkste GAG s. De 9

19 fibroblasten synthetiseren collageen, elastinevezels en glycosaminoglycanen. Collageen vormt het belangrijkste structurele eiwit van de dermis (14;15). De dermis bevat 2 lagen: de papillaire laag en de reticulaire laag. Het losmazig bindweefsel van de papillaire laag is een netwerk van collageen en elastinevezels waarin fibroblasten, bloedcellen en macrofagen gevat zitten. Deze laag vormt een overgang met de bovenliggende epidermis. De reticulaire laag echter heeft een stevig netwerk van parallel gerangschikte collageenvezels en is een veel densere laag (14). De arteriële bloedvoorziening van de huid bestaat uit twee plexussen, één op de grens van hypodermis en dermis en één op de grens van de papillaire laag en de reticulaire laag van de dermis (9). Er bestaan vijf types collageen (I, II, III, IV, V). Specifiek is de aanwezigheid van OH-lysine en OHproline. Vitamine C speelt een belangrijke rol bij de hydroxylering. Collageen wordt gemaakt door fibroblasten en ontstaat uit procollageen. Dit wordt omgezet in tropocollageen waaruit de vezels de eigenlijke collageenfibrillen vormen. Collageen type I is het belangrijkste type collageen in de dermis (85-90%), samen met collageen type III (8-11%). Collageenvezels zorgen voor elasticiteit en stevigheid van de huid en voorkomen de vorming van rimpels. Het doel van nonablative laserbehandeling is het stimuleren van nieuwe collageensynthese in de dermis zonder destructie van de bovenliggende epidermis (14;15). In volwassen huid bestaat de dermis voornamelijk uit collageen type I (80-85%) en type III (10-15%) samen met glycosaminoglycanen en elastinevezels. De afname van collageen type I en III is karakteristiek voor de veroudering van de huid. Collageen type III is het dominante isotype in foetale huid. In de verdere ontwikkeling wordt collageen type I dominant. Tijdens het verouderingsproces, wordt collageen type III geleidelijk aan vervangen door collageen type I (16) Hypodermis In de hypodermis of subcutis lopen talrijke fibreuze banden die de dermis met de onderliggende fascia verbinden. Tussen deze lagen zitten vetkussentjes die enerzijds een structurele functie hebben als mechanische buffer en als isolatie tegen warmteverlies en anderzijds als opslagplaats voor vet fungeren (14). 2.8 Wondgenezing Een wonde wordt gedefinieerd als een onderbreking van de anatomische en/of functionele samenhang van de huid of de mucosa en/of eventueel de dieper gelegen structuren (17). Wondheling is een complex proces dat gepaard gaat met remodelling van de extracellulaire matrix (ECM). Deze remodelling houdt zowel de afbraak en het opruimen van de verschillende componenten in als de productie en afzetting van de nieuw gesynthetiseerde componenten van de ECM. Het evenwicht tussen 10

20 afbraak en aanmaak resulteert ofwel in het behoud ofwel in de wijziging van de structuur en de functies van het weefsel (18;19). Het wondhelingsproces wordt ingedeeld in drie fasen: inflammatie, proliferatie en maturatie of remodelling (17) Inflammatiefase In de inflammatoire fase vinden twee processen plaats: de hemostase en de eigenlijke inflammatie. In een eerste stap reageert het lichaam op de wonde met een vasculaire respons als reactie op de onderbreking van de bloedvatstructuur. Om het bloedverlies te beperken treedt een kortdurende vasoconstrictie op door contractie van de gladde spiercellen in de bloedvatwand. De juncties tussen de endotheelcellen zijn verzwakt waardoor rode bloedcellen en bloedplaatjes migreren vanuit de bloedbaan naar het wondgebied. De bloedplaatjes produceren fibrinogeen met vorming van een plug als reactie op hun contact met extravasculair collageen (17). De inflammatie is het gevolg van de afscheiding van vasoactieve en chemotactische mediatoren. Door de wonde worden immers diverse processen geactiveerd: coagulatie, kininecascade, complementsysteem en arachnoïdinezuurcascade. De gesecreteerde mediatoren zorgen voor een lokale vasodilatatie en een toegenomen permeabiliteit van de capillairen. Dit resulteert in de belangrijkste symptomen van inflammatie: rubor, calor, tumor, dolor en functio laesa (17). Door de chemotaxis worden verschillende cellen aangetrokken tot het wondgebied. De bloedplaatjes produceren adhesieve proteïnen en groeifactoren zoals transforming growth factors (TGF-β) en platelet derived endothelial cell growth factor (PDEGF). Neutrofielen zorgen voor het debrideren van de wonde. Ook lymfocyten worden aangetrokken (17) Proliferatiefase In de proliferatiefase spelen zich verschillende processen af (17): 1. De vorming van de extracellulaire matrix: De macrofaag secreteert fibronectine, een glycosaminoglycan dat een belangrijk bestanddeel is van de ECM. Via dit fibronectine kunnen de fibroblasten migreren naar de wonde. 2. De fibroblast staat in voor de verdere vorming van de ECM via de afscheiding van cytokines en groeifactoren door andere cellen en in het bijzonder dan de macrofaag. De macrofaag secreteert ook proteasen die de migratie van de cellen bevorderen. De fibroblast secreteert eerst proteoglycanen en vervolgens collageen. 3. Angiogenese vindt plaats ter hoogte van de wondrand door de vorming van uitstulpingen aan de uiteinden van de capillairen. Deze uitstulpingen ontstaan door mitose van de endotheelcellen onder invloed van een angiogenese stimulerende factor, uitgescheiden door de macrofaag in hypoxisch milieu. 11

21 4. Tijdens de epithelialisatie prolifereren en migreren de residuele epitheelcellen van de wondbodem en wondrand onder invloed van epidermal growth factor (EGF). Deze cellen differentiëren en verplaatsen zich tot ze met elkaar in contact komen. 5. Gedurende de wondcontractie trekken de wondranden samen met verkleining van de wonde Maturatiefase Tijdens de maturatie of de remodelleringsfase vindt tegelijkertijd synthese en afbraak van collageen plaats. Collageen 3 wordt vervangen door collageen 1, de hoeveelheid vocht en intercellulaire grondstof vermindert en de cross linking tussen de collageenvezels gaat toenemen (17). Intermezzo: Matrixmetalloproteïnasen De resorptie van de ECM gebeurt hoofdzakelijk door matrixmetalloproteïnasen (MMP). Er zijn al 24 verschillende types MMP s geïdentificeerd waarvan er 23 bij de mens teruggevonden zijn. De MMP s zijn onderverdeeld in 4 subfamilies: interstitiële collagenasen, gelatinasen, stromelysines (MMP-3, -10, -11) en membraantype MMP s (MT 1-4-MMP) (19). Collagenasen (MMP-1, -8-13) knippen interstitieel collageen type I, II en III specifiek ter hoogte van ¾ van de N-terminus. Gelatinasen (MMP-2, -9) ruimen gedenatureerd collageen of gelatine op. Bovendien zal MMP-2 ook collageen type I, II en III verteren (18;19). De activiteit van matrixmetalloproteïnasen wordt sterk gereguleerd door: controle van de conversie van pro-enzym naar de katalytische vorm (18). tissue inhibitors of metalloproteïnases (TIMP s). Dit is een familie van 4 structureel gerelateerde proteïnen die specifiek de MMP s inhiberen (18;19). membraanverankerd glycoproteïne RECK (reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs). RECK speelt een cruciale rol in het behoud van de integriteit van de ECM. Door MMP- inhibitie, blokkeert RECK ook celmigratie en houdt het tumorinvasie tegen (19). 12

22 3. Methodologie De doelstelling van dit literatuuronderzoek is om na te gaan wat gekend en beschreven is in de wetenschappelijke literatuur rond de histologische, biomoleculaire en biochemische effecten van pulsed dye lasertherapie op de huid. In de discussie gaan we na of deze gegevens inderdaad een verklaring kunnen bieden voor de beschreven klinische effecten van de PDL. Om tot onze artikels te komen, maken we gebruik van de databanken PubMed en Isi Web of Science. Het design van de studie werd niet als restrictiecriterium gebruikt. In eerste instantie werd gezocht naar het algemene mechanisme van laser en in het bijzonder van de pulsed dye laser. Hiervoor werden in PubMed de MeSH-termen Lasers, Dye/therapeutic use ingegeven. Deze zoekactie werd vervolgens verfijnd met restrict to major topic headings only. Dit leverde een totaal van 96 artikels op. Samen met het boek Laser and light tissue interactions droegen deze artikels bij tot het schrijven van de inleiding. Voor de resultaten werd specifiek gezocht op de zoektermen: nonablative laser treatment AND skin/radiation effects. Bijkomende zoektermen die gebruikt werden waren: pulsed-dye laser, collagen, hydroxyproline, extracellular matrix, matrix metalloproteinases, mrna, vascular lesions. Om specifiek te zoeken naar dierstudies hebben we gebruik gemaakt van Limits: Animals. Vervolgens werden ook artikels gezocht via referentielijsten van verschenen artikels of werd via ISI Web of Science gezocht naar citaties van een artikel. Er werd afgesproken om tot november 2010 relevante publicaties op te zoeken. In deze masterproef werden enkel artikels gebruikt die binnen de tijdspanne van 1981 tot 2010 gepubliceerd werden. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen studies uitgevoerd op 1) dieren, 2) in vitro, 3) normale huid en 4) pathologische huid. Alle resultaten van de gevonden artikels worden volgens deze indeling besproken. Hierbij wordt een onderscheid gemaakt tussen de verschillende fasen van een studie die moeten doorlopen worden om tot een algemene conclusie te komen die toepasbaar is op humane huid. 13

23 4. Resultaten We onderzoeken welke de histologische, biochemische en biomoleculaire effecten van pulsed dye laser zijn op de huid. Daarvoor kijken we achtereenvolgens welke studies al uitgevoerd zijn op dieren, in vivo, op normale humane huid en daarna in pathologische situaties. 4.1 Diermodel In de literatuur worden zeven studies teruggevonden waarin pulsed dye laser gebruikt wordt op een diermodel (Tabel 1). De studies van Goldman et al (20) en van Anderson et al (21) worden niet besproken aangezien de elektronische versie niet beschikbaar is. Ook de studie van Lin et al (22) gebruiken we niet in onze resultaten. Zij onderzoeken het effect van PDL op stembanden van ratten. De resultaten van deze studie zijn niet te vergelijken met de uitkomst van pulsed dye lasertherapie op humane huid Varkenshuid als model voor humane huid Dahiya et al. (23) ging op zoek naar de beste instellingen voor de pulsed dye laser op varkenshuid om het meest gunstige resultaat te verkrijgen op vlak van dermale remodelling zonder epidermale schade. Van varkenshuid is gebleken dat dit het meest gelijkenis toont met de humane epidermale en dermale structuur in termen van dikte, wondheling en collageensynthese. De belangrijkste outcome in deze studie was een kwantitatieve bepaling van de breedte van collageenvezels om het effect van zowel de nonablative flashlamp pumped pulsed dye laser (FPDL) als van de ablatieve carbon dioxide laser (positieve controle) te bepalen in vergelijking met niet-behandelde huid (negatieve controle). Daarnaast deden ze ook een kwalitatieve beoordeling van epidermale en dermale veranderingen. Deze outcome werd nagegaan na 10 weken na de interventie (23) Breedte van de collageenband De breedte van de collageenbanden verschilde significant als we de behandelde huid vergeleken met onbehandelde huid. De mate van collageen remodelling was niet significant verschillend tussen de ablatieve en nonablative lasertherapie. Een hogere energiedensiteit (7 vs. 4 J/cm 2 ), grotere spotsize (10 vs. 7 mm) en langere pulsduur (20.0 vs. 1.5ms) zijn allen statistisch significant gebleken voor toenemende breedte van de collageenband. Naast toegenomen collageen remodelling in de bestraalde huid, nemen de collageenbundels ook een densere configuratie aan in de dermis en is er een toename van interstitieel vocht (23) Epidermale en dermale veranderingen De dikte van de epidermis veranderde niet. Echter zag men wel vrijstelling van melaninegranules over alle lagen van de epidermis die blootgesteld werden aan de ablatieve laser en de nonablative laser in afwezigheid van koeling. Dit stemde overeen met de klinisch zichtbare postinflammatoire hyperpigmentatie. De dermale dikte nam toe in de behandelde huid (23). 14

24 4.1.2 Muismodel Dang et al voerde een studie uit om de efficiëntie van de PDL en de Nd:YAG laser te vergelijken op vlak van huidverjonging. Zowel het effect op de waterhoudende capaciteit als het effect op collageenformatie werd onderzocht. De studie werd uitgevoerd op 48 Kunming (KM) muizen die achtereenvolgens behandeld werden met een 595 nm PDL (7 mm spot, 12 J/cm 2, pulsbreedte van 10 ms) en een 1320 nm Nd:YAG laser. De rug van de muizen werd geschoren en verdeeld in vier zones van 2 x 2 cm. De linker zones werden met de PDL- en de Nd:YAG- laser behandeld terwijl de rechter zones fungeerden als bijhorende controlegebieden. Evaluatie van histologische en biochemische veranderingen werd uitgevoerd op dag 0, 1, 7, 21, 30 en 60 na de twee laserbehandelingen. Histologische analyses werden uitgevoerd met enerzijds een hematoxyline en eosine kleuring (H&E) en anderzijds met een Sirius red kleuring. Sirius red wordt gebruikt om collageen type I en collageen type III van elkaar te onderscheiden onder een polarisatiemicroscoop. Collageen I vezels kleuren helderrood aan, terwijl collageen type III vezels zichtbaar worden als groene vezels. Om de mate van verbetering van de waterhoudende capaciteit van de huid en de snelheid van hydroxyprolinesynthese te kwantificeren, wordt de hydratatie en de hydroxyproline-inhoud van de huid geanalyseerd (15). Liu et al voerden een gelijkaardige vergelijkende studie uit tussen 4 nonablative lasers op een KM muismodel (16). Een 595 nm PDL (10 ms pulsduur), 1320 nm Nd:YAG laser (0.35 ms), 1064 nm Nd:YAG laser met lange pulsduur (0.3 ms) en 1064 nm Nd:YAG laser Q-switched (5 ns) werden met elkaar vergeleken om het collageenremodelling proces te evalueren (16) Waterhoudende capaciteit van de huid Onmiddellijk na de bestraling met een 595 nm PDL observeerden Dang et al een stijging van de hydratatie van de huid. Deze toename normaliseerde 7 dagen na de behandeling als we vergeleken met de niet-behandelde gebieden. De 1320 nm Nd:YAG daarentegen veroorzaakte tot dag 7 geen enkele verandering op gebied van de hydratatie. Na 21 dagen induceerden beide lasersystemen een toename van de waterinhoud van de huid in vergelijking met de controles. Zestig dagen na de behandeling was de huidhydratatie duidelijk hoger vergeleken met de respectievelijke controlegebieden. De hydratatie bedroeg 23.2 % met de 595 nm PDL en 32.9 % met de 1320 nm Nd:YAG. De 1320 nm laser is superieur aan de PDL voor het verbeteren van de waterhoudende capaciteit van de huid (15). Retentie van water is één van de belangrijkste biologische functies van hyaluronzuur. De stijging van de waterhoudende capaciteit van de huid wijst dus op een toename van de concentratie van hyaluronzuur in de extracellulaire matrix. Hierdoor vermoeden we dat de 1320 nm Nd:YAG laser effectiever is in de productie van hyaluronzuur dan de PDL (15) Histologische veranderingen Bestraling door een 595 nm PDL induceert dilatatie van kleine bloedvaten en extravasatie van rode bloedcellen, wat niet gezien werd bij de 1320 nm Nd:YAG (15;16). Dit wordt verklaard aan de hand 15

25 van het werkingsmechanisme van beide lasersystemen. De PDL emitteert geel licht wat selectief opgenomen wordt door hemoglobine en oxyhemoglobine. De penetratie van de laser is beperkt omdat het licht verstrooid wordt in de epidermis. Deze vasculaire hemoglobineabsorptie leidt tot endotheeldysruptie, cytokineactivatie en collageenremodelling (15). De penetratiediepte van de laser is beperkt omdat het licht verstrooid wordt in de epidermis. De PDL heeft vooral een thermisch effect, beperkt tot de oppervlakkige lagen van de huid. De 1320 nm Nd:YAG- laser daarentegen heeft een golflengte in het infrarood spectrum die goed penetreert in de papillaire en midreticulaire dermis en daar voornamelijk geabsorbeerd wordt door water (16;24). De long-pulsed 1064 nm laser wordt voornamelijk geabsorbeerd door proteïnen en water. Door de verstrooiing van het licht met deze golflengte ontstaat er een lichte dermale verwonding. Na behandeling met de Q-switched 1064 nm Nd:YAG zien we dilatatie van kleine bloedvaten, oedeem in de dermis en inflammatoire veranderingen. Men vermoedt dat deze laser de morfologie van de huid doet veranderen door middel van een inflammatoire reactie. De Q-switched 1064 nm Nd:YAG heeft een zeer korte pulsduur (5 ns) en veroorzaakt vooral schade door een fotomechanisch effect. De stralen worden minder door water geabsorbeerd en minder verstrooid wat resulteert in een relatief diepere dermale wonde (16). Bij elk van de lasers zien we na 24 u uitgesproken oedeem en een acute inflammatoire reactie in de dermis met neutrofielen en monocyten (15;16). Dit wordt gevolgd door lymfocyten die in groten getale verschijnen 1 week na lasertherapie (16). Na 1 week zijn deze inflammatoire veranderingen verdwenen, maar zien we proliferatie van fibroblasten en een toename van de epidermale dikte. Deze toename is echter niet statistisch significant (15;16). Na vier weken, was de toename van collageen en fibroblasten zeer uitgesproken en geassocieerd met een dikkere epidermis. De grootste toename van het aantal fibroblasten was te merken bij de Q-switched Nd:YAG op 4 weken na de behandeling. Dit aantal nam in dezelfde mate toe tot 8 weken na therapie, terwijl de epidermale dikte op een tijdstip van 8 weken terugkeerde naar normale waarden (16). Op dag 21 observeerden we een toename van het aantal collageenvezels (15;16). Dit varieerde van gedesorganiseerd collageen met een gereduceerde affiniteit voor de Sirius red kleuring tot nieuwe collageensynthese met een verbeterde organisatie van de collageenfibrillen (16). Deze nieuw gevormde collageenvezels hadden een grotere affiniteit voor de kleuring dan de controles (15;16). Op dag 30 en 60 was de epidermale en dermale dikte samen met het aantal collageenvezels opmerkelijk gestegen in vergelijking met de onbehandelde gebieden. De 1064 nm Q-switched Nd:YAG laser induceerde meer histologische verbetering samenhangend met het aantal fibroblasten en collageensynthese (16). De histologische veranderingen van de huid zijn duidelijker na behandeling met de 595 nm PDL dan met de 1320 nm Nd:YAG (15). De long-pulsed 1064 nm laser veroorzaakte minder collageensynthese en remodelling in vergelijking met de andere drie lasers. Hieruit blijkt dat 16

26 de 1064 nm Q-switched Nd:YAG laser die gepaard ging met de meeste dermale schade ook het meest effectief is in het induceren van collageenremodelling. Fotomechanische interactie tussen laser en weefsel blijkt meer effectief te zijn in collageenremodelling dan fotothermische interactie (16). Bij Dang et al (15) toonde de Sirius red kleuring zowel een stijging van collageen type I als van type III aan. De omvang van de toename van collageen type I was groter met de pulsed dye laser dan met de Nd:YAG- laser: een groei van meer dan 50 % in respectievelijk 75% en 42%. Een toename van collageen type III van meer dan 25% was te zien in 75% van de gebieden behandeld met PDL en in 50 % van de gebieden behandeld met Nd:YAG. Samenvattend levert de pulsed dye laser een grotere winst op aan collageen, voornamelijk collageen type I (15). In de studie van Liu et al (16) zagen we voor de vier laserbehandelingen ook een stijging van zowel collageen type I als van collageen type III. De Q-switched 1064 nm laser geeft meer synthese van collageen type III, terwijl bij de andere lasers de synthese van collageen type I, deze van collageen type III overschrijdt. Fotomechanische interactie tussen laser en weefsel zoals bij de Q-switched 1064 nm Nd:YAG laser bevordert in hoofdzaak de synthese van collageen type III. Dit type van collageen is hoofdzakelijk aanwezig in jonge huid. Hiermee suggereert deze studie dat de Q-switched 1064 nm Nd:YAG laser meer effectief zou zijn in het verhogen van de elasticiteit van de huid. De andere drie lasers die schade aanrichten via een fotothermisch effect, bevorderen voornamelijk de vorming van collageen type I (16). De studie doet dus ook veronderstellen dat collageenremodelling sterk afhankelijk is van de interactie tussen weefsel en laser (16) Hydroxyproline Hydroxyproline is een belangrijke substantie van collageen en wordt praktisch niet teruggevonden buiten collageenvezels. Daarom kan het gebruikt worden als maat voor de hoeveelheid collageen. Om na te gaan of de fibroblastproliferatie gerelateerd is aan de toename van collageen bepaalde men de hoeveelheid hydroxyproline in de huid (15;16). In de behandelde gebieden was de hoeveelheid hydroxyproline toegenomen vergeleken met de respectievelijke controles (15;16). Bij Dang et al leidde de PDL tot een 8,7% hogere toename van hydroxyproline dan de 1320 nm Nd:YAG laser. Het verschil tussen beide systemen was niet significant (15). Liu et al toonde ook een toename van de hydroxyproline-inhoud aan voor elke geteste laser 4 weken na therapie die aanhield tot 8 weken na bestraling. De hoeveelheid hydroxyproline toonde een uitgesproken toename in relatie tot de fibroblastproliferatie. Deze positieve correlatie tussen de hoeveelheid hydroxyproline en het aantal fibroblasten was zeer significant. Dit suggereert dat de fibroblastproliferatie in stond voor de toename van hydroxyproline in de huid en dus voor de toegenomen collageensynthese (16). 17

27 4.1.3 Konijnenhuid als model voor cutane vasculaire letsels Hoewel PDL aanvaard wordt als de optimale behandeling voor cutane vasculaire letsels (CVL) zoals wijnvlekken, wordt er nog steeds geen complete klaring bekomen voor deze letsels. Bovendien zijn er vaak multiple behandelingen nodig om een optimale klaring te verkrijgen. De hoofdreden voor het beperkt therapeutisch effect voor CVL is de beperkte coagulatiediepte van grote bloedvaten of bloedvaten die diep in de huid gelegen zijn als reactie op een 585 nm laser. Een laser met een 595 nm golflengte werd geïntroduceerd met het oog op beschadiging van diepere bloedvaten in vergelijking met 585 nm. Er bestaat nog geen consensus over de optimale golflengte voor deze klaring (25-27). Dai et al gebruikt een konijnenoor als model voor CVL in vivo. Het konijnenoor heeft immers een uitgebreide dermale vasculatuur. De invloed van golflengte (585 nm vs. 595 nm) en cryogene spray koeling (CSC) op de door de lasergeïnduceerde beschadiging van dermale bloedvaten werd onderzocht (25). Tien konijnenoren werden elk 6 tot 7 maal bestraald door een FPDL (585nm of 595 nm) en bespoten met 50 ms cryogen stralen. Twee konijnen werden gebruikt om het effect van CSC te evalueren en werden blootgesteld aan cryogenstralen met een duur van 100, 200 en 300 ms. Bij 5 konijnen werd een biopsie afgenomen 2 uur na therapie. Bij de overige 5 werd de biopsie 4 dagen na de therapie afgenomen. De biopsies werden aangekleurd met H&E om de beschadiging van de bloedvaten te evalueren. Daarnaast deed men een TUNEL (terminaal deoxynucleotidyl transferasemediated dutp Nick-End Labeling)-assay om in een vroege fase apoptose op te sporen (25). Als de energiedensiteit van de laserstraal hoger is dan 10 J/cm 2, geeft de 595 nm golflengte aanleiding tot even veel of meer beschadiging aan de dermale bloedvaten dan de 585 nm golflengte. Twee klinische studies hebben echter aangetoond dat de 585 nm golflengte meer effectief is in het verbleken van wijnvlekken dan de 595 nm golflengte bij gelijke pulsduur en energiedensiteit tussen J/cm 2 (26;28). Bloed absorbeert licht van 595 nm veel minder dan van 585 nm waardoor er bij 595 nm minder energie ter beschikking is om de bloedvaten te vernietigen. Er zijn hogere energiedensiteiten nodig bij een golflengte van 595 nm dan bij 585 nm om een beter resultaat te bekomen. Dai et al suggereren dat de grotere beschadiging van bloedvaten bij 595 nm aan een voldoende energiedensiteit (> 10 J/cm 2 ) te verklaren is doordat een groter volume vernietigd kan worden door de diepere penetratie van de stralen in het bloed (25). CSC met een pulsduur van meer dan 100 ms resulteert in een toename van de diepte van de meest oppervlakkig beschadigde bloedvaten. Dit indiceert dat ook de oppervlakkige bloedvaten nietspecifiek gekoeld worden bij deze duur van de cryogenstralen. De coagulatie van deze oppervlakkige bloedvaten kan daardoor in het gedrang komen als de CSC tussen 100 en 300 ms aanhoudt (25). Lasergeïnduceerde beschadiging van de vasculatuur in het konijnenoor was volledig hersteld 4 dagen na bestraling. Blijvende vasculaire beschadiging kan enkel bekomen worden wanneer de basale membraan van de bloedvatwand irreversibel beschadigd is (25). 18