Lespakket: Wat leert DNA over ons verleden? 1

Transcriptie

1

2 Inhoudstafel 1. Inleiding 1 2. Achtergrondinformatie Wat is DNA? Hoeveel soorten DNA bestaan er? Wat veroorzaakt de genetische evolutie? 3 3. Erfelijkheid en uiterlijke kenmerken 4. Wie zijn onze voorouders?

3 Lespakket: Wat leert DNA over ons verleden? 1 1. Inleiding Met de huidige analyse apparatuur zijn we in staat om delen van het menselijk erfelijk materiaal te lezen. Dit betekent dat we de genetische evolutie van de mens kunnen reconstrueren door het DNA van levende wezens en van historische skeletten te analyseren. Speciaal voor dit lespakket hebben we uit een 17e eeuws skelet DNA geëxtraheerd en met gesofisticeerde analysetechnieken bestudeerd. De analyseresultaten leren ons iets over de fysieke kenmerken van deze persoon, maar ook waar de voorouders van deze persoon vandaan kwamen. Vooraleer we deze resultaten bespreken, zullen we eerst dieper ingaan op enkele elementaire aspecten van DNA. 2. Achtergrondinformatie 2.1. Wat is DNA? DNA is één langgerekt, spiraalvormig molecuul. Een DNA molecuul bestaat uit twee ketens die als een spiltrap om elkaar heen zijn gewikkeld. Elke draad bestaat uit een ruggengraat waarop de moleculen Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) of Guanine (G) in een specifieke volgorde zijn gebonden (bv., ATTCCGGA). Deze moleculen vormen de letters waarmee de genetische code wordt geschreven. De letters van de twee om elkaar heen gewikkelde ketens vormen steeds basenparen. De codeletter A in de ene streng past enkel tegenover de codeletter T in de tegenoverliggende streng en de G past enkel tegenover de C. Bijvoorbeeld, de letter G zal zich nooit met een T of een A associëren. DNA is dus een soort code van heel veel basenparen achter elkaar en de volgorde van de basenparen is uniek voor ieder van ons (tenzij eeneiige tweelingen). Een gen bestaat uit een serie letters en bevindt zich steeds op een welbepaalde positie in het DNA materiaal. In Figuur 1 wordt een fragment van een DNA molcule schematisch weergegeven. Fig. 1: Schematische voorstelling van de DNA molcule In 1962 wonnen James Dewey Watson en Francis Harry Compton Crick de Nobelprijs voor het ontrafelen van de DNA structuur. Zoek op het internet de deze molecuulstructuur op.

4 Lespakket: Wat leert DNA over ons verleden? Hoeveel soorten DNA bestaan er? Al het menselijk genetisch materiaal, ook wel het menselijk genoom genaamd, bestaat voor meer dan 99,9995% uit erfelijk materiaal dat zich in de celkern bevindt. De andere % van het genetisch materiaal zit in de mitochondriën van de cellen. Beide soorten genetisch materiaal bestaan uit DNA moleculen. De afkorting staat voor de Engelse naam Desoxyribo Nucleic Acid. Het nucleair DNA kunnen we dan weer in coderend DNA (de genen) en niet coderend DNA opdelen. De grote hoeveelheden niet coderende sequenties (97% van ons DNA) liggen tussen de coderende gebieden binnen één gen (de zogenaamde introns) ofwel tussen de genen zelf. Hun functie is nog steeds niet opgehelderd. Figuur 2 toont een classificatie van de verschillende soorten DNA in het menselijk lichaam. Fig. 2: Classificatie van de verschillende soorten genetisch materiaal. a) Nucleair DNA In de celkern bevinden zich 23 paar chromosomen: 22 paar autosomen en één paar geslachtschromosomen. De autosomen worden traditioneel genummerd naar grootte, waarbij 1 het grootste chromosoom is, en 22 het kleinste. Er zijn daarnaast twee geslachtschromosomen, X en Y. In de lichaamscellen van een man bevinden zich altijd een X en een Y chromosoom en in de lichaamscellen van een vrouw altijd twee X chromosomen. Het Y chromosoom wordt enkel van vader op zoon doorgegeven. De chromosomen bestaan uit 100,000 genen en uit 3,1 miljard basenparen. b) Mitochondriaal DNA Mitochondriaal DNA (mtdna) is een cirkelvormige DNA molecule van slechts basenparen groot, dat zich niet in de celkern maar in de mitochondriën bevindt. Mitochondriën zijn kleine structuren in de cel. Ze zijn verantwoordelijk voor de productie van energie. Omdat in één enkele cel 10 tallen tot 100 en mitochondriën aanwezig zijn tegenover slechts één celkern met nucleair DNA, kunnen we vaak nog voldoende intact mtdna uit historische skeletten extraheren terwijl het nucleair DNA vaak zwaar beschadigd is. Elk kind erft zijn mt DNA uitsluitend via de moeder. In het mitochondriaal DNA zijn er twee niet coderende hypervariabele regio s. Deze regio s noemt men respectievelijk HVR1 (positie ) en HVR2 (positie ) en zijn elk ongeveer 350 nucleotiden lang. Deze regio s zijn zodanig variabel dat twee individuen (behalve voor eeneiige tweelingen) een verschillend DNA profiel

5 Lespakket: Wat leert DNA over ons verleden? 3 hebben. Dit profiel noemt men een DNA vingerafdruk. De mitochondriale DNAprofielen worden vergeleken met een internationaal gebruikte referentiesequentie (Anderson of Cambridge Reference Sequence) Wat veroorzaakt de genetische evolutie? Als we het Y chromosoom van twee willekeurige mannen met elkaar vergelijken, kan je twee soorten genetische verschillen waarnemen. De zogenaamde Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) ontstaan spontaan gemiddeld 1 keer per 100 miljoen generaties. Veranderingen in lengte van Short Tandem Repeats (STRs) ontstaan frequenter (1 keer per 500 generaties). Al deze veranderingen zijn een gevolg van mutaties. We onderscheiden drie soorten mutaties: Puntmutaties: Bij een puntmutatie verandert één base in het DNA indien het zich in een populatie bevindt. Het zijn dit soort veranderingen die ervoor zorgen dat binnen een populatie er verschillende basen op dezelfde positie kunnen voorkomen. Dit zijn de zogenaamde Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs); Deletie: Door mutaties kan het zijn dat een groot deel van het DNA verdwijnt. Meestal is dit een gevolg van een breuk in het DNA. Als het DNA dan niet correct wordt hersteld, verdwijnen er een aantal basen uit het DNA. In figuur 3 is een deletie van vier basenparen getekend. In het DNA kunnen veel grotere deleties voorkomen, van wel honderd of zelfs duizend basenparen. Duplicatie: Hierbij wordt een stukje DNA toegevoegd. Meestal gebeurt dit doordat er bij de replicatie (vermeerdering) van het DNA een stukje twee keer wordt overgeschreven in plaats van één keer. Er kan een duplicatie van slechts enkele baseparen plaatsvinden, maar ook van duizend of meer baseparen. Bijvoorbeeld bij het ene individu wordt het kwartet AATC vier keer herhaald, bij de ander zeven. Deze fragmenten worden Short Tandem Repeats genoemd (STR's, ook wel bekend als microsatellieten). Het aantal herhalingen kan per individu verschillen. Bijvoorbeeld, de vaderschapstest bestaat uit het analyseren van 16 merkers op het Y chromosoom. Deze genetische vingerafdruk moet voor vader en zoon identiek zijn.

6 Lespakket: Wat leert DNA over ons verleden? 4 Figuur 3: Drie verschillende soorten mutaties aan het DNA. Eerst een puntmutatie waarbij één base verandert in een andere (van A naar G) en de complementaire streng verandert mee. De tweede soort mutatie is een deletie van vier baseparen. De vier basen komen na de deletie niet meer voor. Geheel rechts staat de duplicatie. Drie baseparen worden verdubbeld, zodat na duplicatie deze drie baseparen twee keer voorkomen in plaats van één keer. a) Mutaties en polymorfisme Indien een mutatie geen gevolgen heeft voor het organisme, dan zal deze genetische verandering aan het nageslacht worden doorgegeven. Omdat organismes met en zonder deze mutatie naast elkaar blijven voortbestaan, ontstaat er een variatie in DNA. Dit noemen we polymorfisme. Varianten van slechts één nucleotide noemt men in het Engels Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Mutaties in niet coderende stukken van het DNA hebben geen gevolgen voor het individu. Daarom kunnen we in dit DNA een accumulatie aan mutaties terugvinden. Dankzij deze accumulatie aan mutaties kunnen we nagaan waar onze verre voorouders via de vaderlijke en moederlijke lijn vandaan kwamen. Bijvoorbeeld, zo weten we dat de vader steeds zijn Y chromosoom aan zijn zoon doorgeeft en dat beide een identiek Y chromosoom bezitten. Op bepaalde momenten in bepaalde regio hebben zich ooit mutaties op het Y chromosoom voorgedaan. Dit betekent dat alle mannen die deze genetische verandering bezitten dezelfde oervader hebben gehad. Mensen met dezelfde mutatie behoren tot dezelfde familie of stam. Een dergelijke familie noemen we een haplogroep. Indien jij een mutatie hebt waarvan we weten waar en wanneer ze plaatsvond, dan kunnen we de herkomst van je voorouders lokaliseren. Zo kan min of meer worden vastgesteld welk traject over de wereld voorouders binnen een stam de afgelopen duizenden jaren hebben afgelegd. b) Mutaties en natuurlijke selectie Mutaties in het coderend DNA kunnen gunstig of ongunstig zijn. Gunstige mutaties kunnen een organisme sterker maken. Een gunstig gemuteerd organisme is beter aangepast aan zijn leefmilieu. Als de mutaties gunstig zijn, zullen de mutanten zich makkelijker voortplanten dan de oorspronkelijke soort. Uiteindelijk zal de oorspronkelijke soort uitsterven en is de soort geëvolueerd. De meeste mutaties zijn echter ongunstig en kunnen een vernietigend effect op het organisme hebben. Bij epidemies zoals de pest, waar grote aantallen van een soort sterven, kan een kleine groep de ziekte overleven omdat ze meer resistent zijn tegen de ziekte. Charles Darwin beschrijft het evolutiemechanisme van populaties aan de hand van erfelijke veranderingen. Zoek op het internet de principes waar dit mechanisme op is gebaseerd. Wanneer een epidemie een bevolking regelmatig treft, verandert in de loop van de tijd de genetische samenstelling van die bevolking. In het zich herhalende gevecht tegen de ziekte overleven de mensen die genetisch beter bestand zijn tegen de ziekte. De gevoelige individuen worden eerder ziek en sterven, waardoor er uiteindelijk een bevolking met een hogere resistentie ontstaat. Indiaanse volkeren zijn nooit in aanraking geweest met bepaalde Europese ziektes. Ze hebben dan ook nooit resistentie tegen deze ziektes opgebouwd. Noem twee voor ons (onschuldige)

7 Lespakket: Wat leert DNA over ons verleden? 5 ziektes die Europeanen op het Amerikaanse continent hebben geïntroduceerd en waar toen massaal veel indianen aan zijn gestorven. 3. Analyse van nucleair DNA Van het skelet werd op meerdere plaatsen kleine hoeveelheden botmateriaal verwijderd. De plaats van de monsters zijn in onderstaande tekeningen en foto s geïllustreerd. Uit het verwijderde botmateriaal werd het DNA met een silicagebaseerde extractiemethode geïsoleerd. Hiervoor werd telkens 1 gram botmateriaal gebruikt.

8 Chromosoom 1 Lespakket: Wat leert DNA over ons verleden? 6 a) Erfelijkheid en uiterlijke kenmerken Sommige uiterlijke kenmerken zoals de kleur van onze ogen zijn erfelijk. Dit betekent dat we voor levende mensen een verband kunnen zoeken tussen deze kenmerken en ons DNA. Eens dit verband gekend is, kunnen we op basis van DNA analyses deze kenmerken van bijvoorbeeld een historisch skelet achterhalen. Tabel I geeft een indeling van de huid, haar en oogkleur en een beperkt aantal groepen. TABEL I: Classificatie van enkele uiterlijke kenmerken van Europeanen. Haarkleur Huidskleur Oogkleur 1 Blond Bleke huid Blauw of grijs 2 Lichtbruin Lichte huid Groen of hazelnoot 3 Ros Licht getinte huid Bruin 4 Donkerbruin 5 Zwart De oogkleur is een erfelijke eigenschap die door meerdere genen wordt bepaald. Recent werd aangetoond dat het voorkomen van bepaalde DNA sequenties in het OCA2 gen (oculocutaneous albinism type 2) hierin een belangrijke rol speelt. Er werd namelijk aangetoond dat er drie puntmutaties (SNP) aanwezig zijn in dit gen die in belangrijke mate bijdragen tot het bepalen van de oog, haar en huidskleur. Elke mens bezit twee kopieën van elk gen en dus ook van deze puntmutaties. Hierdoor bestaan er dus meerdere combinaties aan puntmutaties in het DNA van elke persoon. Elke combinatie kan met een bepaalde waarschijnlijkheid aan een oog, haar en huidskleur worden verbonden. Deze waarschijnlijkheden zijn in Tabel II samengevat. TABEL II: Relatie tussen de drie puntmutaties op de twee chromosomen en de uiterlijke kenmerken oogkleur, haarkleur en huidskleur. Genotype Oogkleur Haarkleur Huidskleur Chromo Blauw, Groen, Bruin Blond Licht Ros Donker soom 2 grijs hazelnoot bruin bruin Zwart Bleek Licht Licht getint TGT TGT 62,5 28,0 9,5 16,2 40,2 5,1 37,0 1,5 46,5 4,61 7,4 TGT TTC 47,1 20,3 32,6 15,2 29,7 3,6 44,2 7,2 35,6 47,4 17,0 TGT CGT 28,6 14,3 57,1 0,0 14,3 0,0 57,1 28,6 14,3 57,1 28,6 TGT TGC 27,9 22,1 50,0 9,7 26,0 7,8 49,4 7,1 29,3 56,7 14,0 TGC TTC 25,0 8,3 66,7 8,3 8,3 8,3 16,7 58,3 27,3 18,2 54,5 TTT TGC 20,7 31,0 48,3 3,4 37,9 0,0 51,7 6,9 40,0 36,0 24,0 TTT CGC 20,0 20,0 60,0 20,0 40,0 20,0 20,0 0,0 60,0 20,0 20,0 TGT TTT 17,6 38,5 44,0 9,1 25,8 6,3 53,0 5,8 35,1 53,0 11,9 TGT CTC 7,9 23,3 68,8 4,3 21,3 3,6 62,5 8,3 25,1 50,6 24,3 TTT TTC 5,6 11,1 83,3 16,7 16,7 5,6 61,1 0,0 16,7 44,4 38,9 CTC CTC 4,5 0,0 95,5 4,5 4,5 0,0 45,5 45,5 10,5 42,1 47,4 TTT TTT 0,0 35,3 64,7 0,0 17,6 5,9 70,6 5,9 26,7 60,0 13,3 TTC CGT 0,0 33,3 66,7 0,0 33,3 0,0 66,7 0,0 66,7 33,3 0,0 TTC CTC 0,0 23,1 76,9 7,7 23,1 0,0 53,8 15,4 9,1 63,6 27,3 TTT CTC 0,0 21,4 78,6 7,1 14,3 14,3 50,0 14,3 35,7 50,0 14,3 TGC CTC 0,0 5,6 94,4 0,0 11,1 0,0 72,2 16,7 23,5 11,8 64,7 TTC TTC 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0 0,0 33,3 66,7 0,0 0,0 100,0 TGT CTT 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0 100,0 0,0 TTT CGT 0,0 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 0,0 TGC TGC 0,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 0,0

9 Lespakket: Wat leert DNA over ons verleden? 7 De resultaten van de nucleaire SNP analyse van de beide tanden toonden aan dat elk van de 3 SNPs heterozygoot waren. Dit wil zeggen dat de twee genkopieën telkens een andere DNA sequentie hebben. Op basis van deze vaststelling zijn er drie SNP combinaties mogelijk (zie rode aanduiding in Tabel II). Men kan hieruit besluiten dat de vrouw waarvan het skelet afkomstig is met een grote waarschijnlijkheid bruine ogen (> 60% waarschijnlijk), (donker)bruin haar en een bleke tot lichte huidskleur had. b) Nucleaire STR analyse Het nucleaire DNA van het historisch skelet bleek uit vele kleine stukken uit ellkaar te zijn gevallen. Deze stukken waren meestal kleiner dan 200 basenparen. Toch was dit voldoende voor het uitvoeren van de analyses. Enkel voor de analyse waar langere ketens nodig zijn, werden er geen resultaten geboekt. Hier dient wel te worden opgemerkt dat niet elk skeletonderdeel dezelfde hoeveelheid DNA bevat. De DNA ketens waren nog voldoende lang om van het nucleaire DNA het aantal repeats van 13 verschillende STRs te bepalen. Het Amelogenin gen bevindt zich op de geslachtschromosomen (X en Y). Van dit gen werd de lengte bepaald. Voor een X chromosoom is de lengte van dit gen 106 basenparen en voor het Y chromosoom 112 basenparen lang. Deze STRs bevinden zich op meerdere chromosomen. Een mens bezit dezelfde STR op de twee chromosomen. De lengte van de STR op de twee chromosomen kan even lang zijn (homozygoot) of verschillend (heterozygoot). Het geanalyseerde patroon is voor elke mens uniek. De kans dat een andere persoon hetzelfde DNA profiel heeft, is 1/( ). Het belangrijkste wat we uit deze analyse kunnen leren dat het om een skelet van een vrouw gaat. TABEL III: Het aantal repeats van de geanalyseerde STR s uit botmateriaal van vijf verschillende posities. Voor elke STR bezit de mens twee varianten. Naam STR Locatie STR op het chromosoom Radius Bekken Manubrium sterni Femur Humerus D3S1358 3p vwa 12p12 pter D16S539 16q24 qter D2S1338 2q D21S11 21q11.2 q D18S51 18q TH01 11p FGA 4q TPOX 2p23 2pter CSF1PO 5q D5S818 5q D13S317 13q D7S820 7q AMEL X X X X X X

10 Lespakket: Wat leert DNA over ons verleden? 8 c) Analyse van mitochondriaal DNA Bij mensen wordt het Y chromosoom zonder noemenswaardige veranderingen (met uitzondering van mutaties) van vader op zoon doorgegeven. Hierdoor zullen alle mannen die in een directe mannelijke lijn aan elkaar verwant zijn, een vrijwel identiek Y chromosoom hebben. Toch ondergaat dit Y chromosoom als gevolg van puntmutaties en STR mutaties door de eeuwen heen kleine veranderingen. Op tijdstip 1 was er slechts één soort Y chromosoom. Tussen tijdstip 1 en tijdstip 2 ontstaan door STR veranderingen een hele serie Y chromosomen die allemaal verschillende STR lengtes hebben, maar voor de rest niet van het oorspronkelijke chromosoom zijn te onderscheiden. Individuen met dezelfde soort Y chromosoom behoren tot dezelfde haplotype. Al deze haplotypes behoren tot dezelfde haplogroep. Indien een Y chromosoom een SNP mutatie ondergaat (en deze zijn zeldzamer dan STR mutaties) dan ontstaat er een nieuwe haplogroep. Als gevolg van een accumulatie aan mutaties dienen er meerdere SNPs en STRs te worden onderzocht om de juiste haplogroep en haplotype te achterhalen. Mannen die in de directe mannelijke lijn aan elkaar verwant zijn, geven niet alleen hun Y chromosoom door, maar ook hun achternaam. Via DNA onderzoek kunnen we bijvoorbeeld alle mannen met de familienaam Lambrechts in meerdere DNA profielen classificeren. Ook migratiestromen van vele duizenden jaren kunnen we met dit soort onderzoek in kaart brengen. Indien we weten waar en wanneer bepaalde haplogroepen of haplotypes zijn ontstaan, kunnen we via DNA onderzoek prehistorische migratiestromen bestuderen en nagaan waar de voorouders van een persoon vandaan kwamen. Via het Y chromosoom kunnen we de migratiestromen van de mannelijke lijn bestuderen; via het mitochondriaal DNA kunnen we de migratiestromen van de moederlijke lijn bestuderen. Volgende haplogroepen van mtdna kunnen biogeografisch onderscheiden worden: Zuid Europeanen: J, K Noord Europeanen: H, T, U, V, X Midden Oosten: J, N Afrikanen (sub Sahara): L Aziaten: A, B, C, D, E, F, G Amerindianen: A, B, C, D, X

11 Lespakket: Wat leert DNA over ons verleden? 9 Van het 17e eeuws skelet werd de volledige nucleotidensequentie van de hypervariabele regio I (nucleotidepositie ) en de hypervariabele regio II (nucleotidepositie 1 437) van het mtdna bepaald. Het haplotype wordt achterhaald door deze nucleotidesequentie met de Cambridge Reference Sequence (CRS) te vergelijken. Vergeleken met deze CRS vertoont de Antwerpse vrouw volgende verschillen: 263A>G, 315.1C (insertie) en 16093T>C. Dit haplotype behoort tot de mitochondriale haplogroep H, de meest frequente haplogroep bij personen van Europese origine. Van willekeurige personen, verzameld via The Genographic Project, waren er (38%) van haplogroep H. Van 175 personen waarvan de voorouders uit de Benelux afkomstig zijn en die op genealogische websites zijn geregistreerd, waren er 65 (37%) van deze haplogroep. Brian Sykes, professor genetica in Oxford, heeft in het boek The Seven Daughters of Eve de haplogroep H de naam Helena gegeven. In EMPOP ( dé referentiedatabase voor mitochondriale haplotypes, wordt het haplotype van het 17e eeuwse skelet drie keer teruggevonden, tussen extante haplotypes (DNA van nu levende personen)! Deze 3 personen zijn van Innsbrück, Madrid en Budapest afkomstig. Dit betekent niet meer of minder dat de vrouw van het 17e eeuwse skelet begraven in de Kathedraal van Antwerpen, verwanten heeft langs ononderbroken vrouwelijk/moederlijke lijn, die nù leven in Oostenrijk, Spanje en Hongarije! Het betreffende haplotype wordt geen enkele maal teruggevonden onder 348 Afrikanen, noch onder 349 Aziaten.

12 Lespakket: Wat leert DNA over ons verleden? 10 Colofon Dit project wordt ondersteund binnen het actieplan Wetenschapsinformatie en Innovatie, een initiatief van de Vlaamse overheid Opdrachtgever Vlaamse Gemeenschap, project wetenschapsinformatie met nr. WI/2003/062 Promotor Prof. Dr. Koen Janssens Universiteit Antwerpen, Campus Drie Eiken, Departement Chemie Universiteitsplein 1, B 2610 Wilrijk Concept Olivier Schalm, Medewerker aan het Departement Chemie Universiteit Antwerpen, Campus Drie Eiken, Departement Chemie Universiteitsplein 1, B 2610 Wilrijk olivier.schalm@ua.ac.be Partners Hildegard Van de Velde en Paul Van Iersel Rockoxhuis Keizerstraat 12, 2000 Antwerpen Tim Bellens Consulent archeologie Stad Antwerpen, Stadsontwikkeling Afdeling archeologie Kathleen Art Coördinator Pienternet Provinciale Ontwikkelingsmaatschappij (POM) Antwerpen Lange Lozannastraat 223, 2018 Antwerpen Medewerkers Kristien Aertssen, Janna Beck, Herbert Binneweg, Erica Chaffart, Marek De Bisschop, Johan Devrome, Ann Geerinck, Oswald Pauwels, Michael Segers, Anne Stubbe, Clara Suetens, Yvette Verlinden en de studenten van Bachelor 2 en Bachelor 3 Afstudeerrichting Grafische vormgeving Koninklijke Academie voor Schone Kunsten Antwerpen Keizerstraat 14, 2000 Antwerpen Natalie Ortega en de studenten Bachelor 2 Opleiding Conservatie/Restauratie Hogeschool Antwerpen Blindestraat 6/9, 2000 Antwerpen Marc Hendrickx Antwerpse Vereniging voor Bouwhistorie en Geschiedenis Kipdorp 37/21, 2000 Antwerpen Bas Bogaerts, Steven Delrue Playing the past vzw Sponsors Antwerpen Boekenstad Met dank aan Dit document kon nooit worden verwezenlijkt zonder de steun van het Stadsarchief. Marc Hendrickx vond de basisakten die met de woning Groote Schaliën Loove te maken hadden. Bovendien nam hij het zeer arbeidsintensieve werk van het transcriptieprobleem van tal van documenten op zich. Ook Hugo Lambrechts zette me op het spoor van diverse akten, vond er erg veel nieuwe en maakte ze begrijpelijk. Tenslotte ook dank aan Kristin Paillet en Annie Grégoire voor hun bijdrage in het transcriberen van enkele documenten.